pcr需要注意的问题

1、PCR产物的电泳检测时间：一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。

2、假阴性，不出现扩增条带

模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增。

对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

3、假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

4、出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

5、出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。

参考资料来源：百度百科-PCR扩增

核酸检测技术有诸多优点，但由于其超高的灵敏度，一旦实验室出现核酸污染，很容易导致假阳性结果，从而影响检测的准确性。

因此了解核酸污染原因和清除核酸污染是分子检测实验室的工作重点。

一、核酸实验室污染的产生

在新冠病毒核酸检测过程中 ，常见以下几种污染类型 ：①标本污染；②试剂污染；③ 产物污染；④ 设备污染；⑤ 其他污染。

实验室应发现污染其解决措施：

①标本污染：重新采样进行检测，评估标本前处理环节；

②试剂污染：更换新的试剂重新检测评估；

③设备污染：设备整体消毒清洁、维护；

④产物污染：全面清洁消毒实验室、仪器设备所有实验有关用品。

实验室的污染不可能一次就清理干净，需反复清理验证，直到实验结果能被采用为止。

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在实际工作中，实验室可能会因实验过程的操作造成污染而导致“假阳性”。据其分析，污染来源主要有两个方面：

其一，是扩增产物的遗留污染，在大规模核酸筛查的过程中，由于样本量大、采取的又是“停人不停机”的连续工作方式，每轮扩增检测之间的清洁可能不到位，同时也无法保证每个扩增管完全密闭，带来“假阳性”的可能。

其二，检测过程中，样本之间可能会发生交叉污染，比如，阳性样本或者实验室所用的质控品污染了本来为阴性的样本，这也会造成的“假阳性”。

除实验室污染外，“假阳性”的出现也可能是因不规范操作所致。个别实验室包括技术人员没有严格按照规定的工作程序进行操作，这是引发“假阳性”的另一种可能。

二、核酸实验室污染的防控

进行PCR操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的PCR污染或杜绝污染的出现。

(一) 严格实验室功能分区

目前，实验操作在不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：

1. 试剂准备区。

2．标本制备区。

3. PCR扩增区及分析区。

各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。

（二）确保实验室人、物及空气流动

核酸检测实验室的人、物及空气流向按照试剂储存和准备区→样本制备区→扩增和产物分析区，防止扩增产物随人流、物流及空气进入扩增前的区域。空气流向应按照从试剂储存和准备区→样本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。

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（三）实验操作注意事项

1.实验前安全要求

①实验室工作桌面、台面及地面消毒：应使用0.2%含氯消毒剂或75%酒精，消毒液不得超过24小时。

②转运桶及标本消毒：转运至实验室的标本转运桶应在生物安全柜内开启。转运桶内壁和标本采集密封袋进行喷洒消毒。取出标本采集管后，应首先检查标本管外壁是否有破损、管口是否泄露或是否有管壁残留物。

③如为采样管为非灭活管，实验室操作人员在进行标本热灭活时，温浴前需旋紧标本采集管管盖，必要时可用封口膜密闭管盖；温浴过程中可每隔10分钟将标本轻柔摇匀1次，以保证标本均匀灭活；温浴后标本需静置至室温至少10分钟使气溶胶沉降，随后再开盖进行后续核酸提取。

2.核酸提取和检测安全要求

标本进行核酸提取和检测时应尽可能在生物安全柜内进行操作。如为打开标本管盖或其他有可能产生气溶胶的操作，则必须在生物安全柜内进行。

3.实验结束后清洁要求

①实验室空气清洁。实验室每次检测完毕后，可采用房间固定和/或可移动紫外灯进行紫外照射2小时以上。必要时可采用核酸清除剂等试剂清除实验室残留核酸。

②工作台面清洁。每天实验后，使用0.2%含氯消毒剂或75%酒精进行台面、地面清洁。

③生物安全柜消毒。实验使用后的耗材废弃物放入医疗废物垃圾袋中，包扎后使用0.2%含有效氯消毒液或75%酒精喷洒消毒其外表面。手消毒后将垃圾袋带出生物安全柜放入实验室废弃物转运袋中。试管架、实验台面、移液器等使用75%酒精进行擦拭。随后关闭生物安全柜，紫外灯照射30分钟。

④转运容器消毒。转运及存放标本的容器使用前后需使用0.2%含氯消毒剂或75%酒精进行擦拭或喷洒消毒。

⑤塑料或有机玻璃材质物品清洁：使用0.2%含氯消毒剂或过氧乙酸或过氧化氢擦拭或喷洒。

（三）核酸实验室污染的处理

实验室一旦发生污染，检测工作应立即停止，直到确认消除污染后才能重新开始检测。

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1.标本污染生物安全柜的操作台造成局限污染时：

立即用吸水纸覆盖，并使用0.55%含氯消毒剂进行喷洒消毒。消毒液需要现用现配，24小时内使用。

2.标本倾覆造成实验室污染时：

保持实验室空间密闭，避免污染物扩散。立即使用润湿有0.55%含氯消毒剂的毛巾覆盖污染区。必要时（如大量溢撒时）可用过氧化氢加热熏蒸实验室，剂量为2g/m³，熏蒸过夜；或20g/L过氧乙酸消毒液用气溶胶喷雾器喷雾，用量8ml/m³，作用1-2小时；

3.清理污染物时：

严格遵循活病毒生物安全操作要求，采用压力蒸汽灭菌处理，并进行实验室换气等，防止次生危害。

因核酸实验室污染后难以清除，有可能造成实验室不能使用的风险。但是如果一旦出现核酸实验室污染，除了上面常规的消毒清洁之外，另外可采用专门的实验室污染去除仪去除实验室核酸污染。

仅供医学人士参考

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