如何分离细胞核与线粒体

细胞核与线粒体的分级分离

一、原理

细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。

分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。

匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。

分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。

分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。

二、细胞核的分离提取

(一)操作步骤

1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。

2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。

3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。

4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；(3)余下的沉淀物进行下一步骤。

5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。

6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。

(二)结果

分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。

三、高速离心分离提取线粒体

(一)操作步骤

1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。

2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签)。

3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。

(二)结果

油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。

影响线粒体分离纯化的关键因素：

细胞核

线粒体分离纯化，线粒体普遍存在于真核细胞中(成熟红细胞除外)，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，细胞生命活动所需的能量大约95％来自线粒体。在肝脏、肌肉、心脏和脑组织中含量丰富。线粒体的提取普遍采用的是密度梯度离心的方法，因为线粒体的体积较小，需要较高的转速和较长的时间才能使其沉淀。在要求更高的实验中，需要使用超速离心机和密度梯度离心方法将粗提的线粒体进一步纯化。

为保证线粒体的活性，一般需要在低温条件(4℃)下操作。细胞或组织匀浆后，先低速(1500g)离心，去除未破碎的细胞、细胞核和大的碎片。将收集的上清液以12 000g离心15分钟，收集沉淀，即可获得线粒体粗提物。必要条件下可以重复一次。线粒体的纯化主要依赖蔗糖密度梯度超速离心方法获得，配制15％、23％、32％和60％蔗糖溶液，134000g离心1小时，收集60％和32％界面交界处的棕色带，可获得较纯的线粒体。

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