大家在qPCR实验过程中，是否会经常遇到异常扩增曲线和熔解曲线的困扰呢？比如CT值大于30的扩增曲线、出现杂峰的熔解曲线、无法扩增出来的目的基因......甚至还有各种千奇百怪让人头大的问题。
今天小编就为大家整理了关于qPCR的常见问题与分析，助力大家跑出完美漂亮的qPCR曲线~
RNA提取
RNA提取是RT-qPCR实验成功的敲门砖，RNA的质量直接关乎整个RT-qPCR实验的成败。但翻车总在不经意间，其实主要的原因在于RNA的分子结构的不稳定性、环境中无处不在的RNase以及环境温度对RNA 的降解造成的加速作用，那么如何提取出高质量的RNA呢，小编给你以下建议：
1. 样本的选择：
我们进行RNA提取的样本最好选择新鲜的细胞样本和组织样本
2. 样本的采集和保存：
采集样本时，尽量在低温环境下采集，不要将样本置于室温环境下，建议采集样本后先在液氮中速冻然后再转移到负80度冰箱保存或干冰运输。获取样本后，最好立即提取RNA，如需要将组织样本进行长途运输，则应将样本放于充足的干冰中进行远途运输，切忌使用冰袋进行运输；对于细胞样本，建议将细胞样本保存在Trizol中用干冰进行远途运输。还有就是小编不建议大家用胰酶消化细胞后收集细胞沉淀进行RNA提取，因为胰酶会对细胞活性产生影响，这里建议大家在细胞处理完后将Trizol或细胞裂解液直接加入培养板中进行裂解细胞的收集，用Trizol进行裂解提取RNA时全程在冰上操作防止RNA因温度过高造成降解，这种方法可以保证样本的新鲜程度且保证RNA的完整性。小编这里强烈不建议大家将提取好的RNA进行运输，如需运输要将RNA反转成cDNA，对于提取完的RNA建议立即反转成cDNA，因为与RNA相比cDNA更加稳定不易降解，并且将RNA反复冻融也会造成一定程度的降解。反转好的cDNA需要放入-20℃存放。
Tips:
为了避免环境中的RNase污染，实验前应将实验台面用75%酒精消毒，实验过程全程佩戴口罩、手套等。实验过程使用枪头及EP管等耗材应为RNase-free处理过的，处理不同组织样本时应对剪刀和镊子进行多次消毒，防止样本间的干扰和污染。
为了避免RNA降解，实验过程要尽量处于低温环境，研磨仪适配器应经过-80冷冻处理；如您是手动研磨，建议在研钵中加入液氮后再手动研磨组织或细胞。如果不能确定RNA是否存在降解现象，可进行琼脂糖凝胶电泳判断RNA是否完整及RNA是否存在降解问题，注意跑RNA琼脂糖凝胶电泳跑胶时间不宜过长，若时间过长因跑胶装置产热也会造成RNA降解。对于真核生物来说，完整的RNA应该有三条带，分别是28S、18S及5S，28S与18S的条带亮度之比应为2:1（如图所示）。若发现5s条带亮度很高且28s和18s的条带呈弥散状态，证明RNA已发生严重降解，建议重新进行RNA提取。
cDNA
不知道大家是否遇到过qPCR内参循环数差距太大的情况呢，这里建议大家qPCR的实验中不同样本内参的循环数差异不要超过2个循环，那如果遇到内参不齐这种情况应该怎么办呢？这里小编给你以下建议:
1. 内参不齐(个别cDNA的样本与其他cDNA的样本内参CT值差异在2个循环以上)，可将CT值差异较大的cDNA做不同梯度的倍比稀释进行qPCR，选择CT值差异小于2个循环的cDNA稀释倍数进行实验。一般情况下cDNA稀释一倍，CT值会增大1个循环左右，注意qPCR的正式实验时内参也要整齐呦。
2.将RT完毕的cDNA进行同倍体积的稀释，并将cDNA分装使用，这一步骤是为了减少枪头和吸取的微量cDNA的细微差异而造成的误差，提高三复孔重复性。
扩增CT值偏大
如果某基因第一次扩增，CT值就大于30甚至无法扩增出来，这种情况可能是扩增效率低导致的，也有可能是该基因在待测样本中的表达丰度低。那么遇到这种情况我们应该如何处理呢？
1. 引物质量差：
无法扩增出来这种情况有可能是引物质量差造成的，建议更换引物进行尝试，或者改用灵敏度高的PCRmix来进行实验。
2. 表达丰度低：
针对表达丰度较低的基因，小编建议可以通过提高模板量来改善CT值偏大的问题，比如可以尝试使用一步法来进行实验。在qPCR实验前小编建议大家在网站中查询该基因的表达情况（https://www.uniprot.org/）提前设计适合的试验方案。
3. 扩增产物过长：
扩增产物长度最好不要超过300bp，如果扩增产物过长建议 大家将两步法程序改为三步法进行实验，这样扩增曲线会有一定程度改善。
熔解曲线异常
熔解曲线备用来判断qPCR结果的特异性，理想的熔解曲线为单峰，而异常熔解曲线会出现双峰，杂峰等情况~
1. 双峰，杂峰Tm在80℃之前
可能存在引物二聚体，建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化；也有可能是模板量偏低，促使引物二聚体的形成，建议重新制备纯度较高的cDNA。
2. 双峰，杂峰Tm在80℃之后
引物特异性过低造成非特异性扩增，建议重新设计引物改善特异性，设计后建议用blast验证引物特异性是否良好。
3. 尝试许多方法双峰、杂峰仍无法改善
出现这种情况建议您更换识别能力强，条件兼容性更高的PCR试剂，以我们的实际经验来看，mix的不同会对PCR的结果有不同程度的影响，针对表达丰度低的基因，改变mix会有一定程度的帮助。在这里建议大家在RT-qPCR的实验中不要耗费过多的精力，找到稳定的实验试剂即可。
以上就是小编为大家整理的RT-qPCR实验中常见的问题及具体的处理方式和建议，如果您有其它疑问，欢迎联系我们~
总而言之，qPCR实验从RNA提取到反转定量虽步骤简单，但问题也是层出不穷，希望大家在遇到问题时不要慌乱，找到适合自己的解决方法实验才能稳步进行。在这里天津舍为斯生物技术有限公司，为各位提供专业优质的qPCR实验服务，小编在这里为大家呈现本公司的产品优势，如果感兴趣并且想要了解，欢迎大家来电咨询。
1-100ng/ul（工作浓度）。一般用的最多的是1-100ng/ul（工作浓度）。浓度太低和太高都会影响扩增效率，但并不是绝对的。因为有一些基因表达水平极低，有一些在特殊情况下又极高。qPCR很多时候仅仅反映的是几个样品之间的趋势，而不是绝对值。你先把cdna进行梯度稀释，然后进行pcr，如果你的primer所扩增的ct值在15-25之间，那么就是很不错的稀释梯度。欢迎分享，转载请注明来源：优选云
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