liú shì xì bāo shù
2 英文参考flow cytometry
流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
3 流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是：①测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland –Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。
现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：（1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。（2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面信息，用作鉴别细胞的依据。Kamentsky不仅思路敏捷，而且能身体力行。他是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了多参数数据的人，也是第一个采用了二维直方图来显示和分析多参数的人。
流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla和美国的Los Alamos小组。他们在1967年研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Gohde 和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。
近20年来，国内外在FCM上都做了不少的研究和应用工作，也取得了不少成果。特别是随着仪器和方法和日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作以扩大FCM的应用领域和使用效果。FCM在免疫组织化学中的应用也大致差不多，并注重了在临床应用的推广。
4 工作原理
流式细胞术
将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。
流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模／数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率有512或1024通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。
细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
5 检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
6 流式细胞术的临床应用1．流式细胞术在肿瘤学中的应用：流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡；
2．流式细胞术在血液学中的应用：检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞（CD34+）计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测；
3．流式细胞术在免疫学中的应用：可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。
7 科研应用主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。
8 常规检测时的样品制备8.1 直接免疫荧光标记法取一定量细胞（约1×106 细胞/ml），直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），孵育20～60分钟后，用PBS（pH7.2 ～7.4）洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
8.2 间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液（约1X106 细胞/ml），先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原抗体抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
9 质量控制和注意事项流式细胞仪并非是完全自动化的仪器，准确的实验结果还需要准确的人工技术配合，所以标本制备需要规范，仪器本身亦需要质量控制。
9.1 流式细胞术免疫学检测的影响因素和质量控制流式细胞术在免疫学中有着广泛的应用，其免疫荧光染色的标本制备非常重要，常常由于标本制备过程中出现人为非特异性荧光干扰(尤其在间接免疫荧光染色中)或细胞浓度低等影响检测结果。解决这些影响因素的方法如下：
(1) 确保标本上机检测前的浓度为1X106/ml，细胞浓度过低直接影响检测结果。
(2) 使用蛋白封闭剂，封闭非特异结合位点，尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。常用的蛋白封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。
(3) 荧光抗体染色后充分洗涤，注意混匀和离心速度，减少重叠细胞和细胞碎片。
(4) 设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。
(5)判定结果时，应注意减去本底荧光，为使免疫荧光的定量分析更精确，应用计算机程序软件，用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值，可以得到更准确的免疫荧光定量结果。
(6) 注意染色后避光，保证细胞免疫荧光的稳定。
9.2 DNA倍体分析的质量控制DNA倍体分析的质量控制仍没有统一的标准， 各文献报道的实验结果差异较大，1993年10月美国癌症研究组织制定了FCMDNA定的统一标准，我们根据这些标准并结合国内有经验的专家多年的实践，对FCM的DNA分析技术的质控和注意事项进行说明。
(1) 手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。
(2) 标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。
(3) 固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度，70%的乙醇固定效果较好。
(4) 单细胞悬液制备过程中，注意将待测细胞成分分离出来，减少其他成分的干扰，并注意不要损伤该群细胞。
(5) 细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度，即1X106/ml，杂质、碎片、团块和重叠细胞应<2%，对肿瘤细胞DNA异倍体的分析样品，至少有20%的肿瘤细胞存在。
(6) 石蜡包埋组织单细胞制备时要注意：取材时应选取无自溶、坏死的组织，对肿瘤组织标本，选取含肿瘤细胞丰富的区域；石蜡组织片的厚度要适宜，最好为40～50μm 。过薄或过厚的切片均会影响检测结果；彻底脱蜡，以免残留的石蜡影响酶的消化活性，验证脱蜡是否完全的方法是弃去二甲苯，加入100%乙醇，如果无絮状物浮起，说明蜡已脱净；水化要充分，使组织还原到与新鲜组织相似的状态；注意消化的时间和消化酶的活性。常规使用0.5%胃蛋白酶，pH 1.5。
9.3 操作(1)流式细胞仪在整个工作过程中处于最佳状态，能保证定量检测的准确性和检测精度。使用标准样品调整仪器的变异系数在最小范围，分辨率在最好状态，能避免在测量过程中仪器条件的变化引起的检测误差。
(2)评价仪器精度的重要指标是仪器的变异系数（CV），对于校准样品，其CV值越小越好，CV值越小，说明仪器校正的精度越高。校准样品包括非生物样品（荧光微球）和生物细胞样品（人淋巴细胞、鸡红细胞等）。目前，非生物荧光微球已有商品试剂，CV一般<2%～3%。
9.4 资料分析(1) 当样品中碎片杂质或团块过多，所测细胞数在20%以下，组方图的基线抬高时，应放弃分析处理。
(2) 做细胞周期分析时，样品细胞数应在1万个，排除碎片、杂质和团块，当异倍体细胞数占总细胞数10%以下时，需要结合其他诊断指标，不可盲目下结论，至少异倍体细胞占总细胞数的20%以上，可以确定异倍体的存在。
(3)DNA分析时，正常二倍体细胞组方图CV值>8%时放弃分析，但肿瘤细胞的CV值>8%，与肿瘤细胞的异质性有关。另外，DNA倍体分析时，同源组织的不同个体会出现10%的漂移。
FSC通道
FSC，即前向角散射，它的值代表细胞的 大小 。所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小，利用FSC值对细胞进行分群和分类。
SSC通道
SSC，即侧向角散射，它的值代表 细胞的颗粒度 （granularity）。细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，利用SSC值对细胞进行分群和分类。
检测样品中是否含有细胞表达某一CD分子——标记荧光素偶联的该CD分子的抗体——表达有该CD分子的细胞就会结合荧光素偶联抗的该CD分子的抗体——荧光素被相应的激光激发后产生荧光——荧光通道值反映接收到的荧光信号的强弱，——反映细胞上结合的荧光素的量，反映细胞上表达该CD分子的量——间接反映细胞表达某CD分子这一化学特征
不同细胞群的FSC值和SSC值最多相差几倍，而荧光信号强弱之间一般相差很大，阴性细胞与阳性细胞之间、强阳性与弱阳性之间有时可以相差几十倍、几百倍，甚至几千倍，呈指数关系。 流式图数轴上FSC值和SsC值以“一般数序形式”表示，而荧光通道值常以“对数形式”（logarithmic scale）表示
流式直方图的x轴表示一个通道的值,y轴表示细胞数量。
流式直方图只能表示一个通道的信息，而流式散点图能够同时表示两个通道的信息，可以非常直观地发现细胞群体中这两个通道值的相互高低关系，从而更易于细胞分群、分类，以及确定比例关系等。
流式散点图也是采取坐标轴的方式，x轴表示一个通道的值，y轴表示另一个通道的值，图中每一点代表一个细胞，该点所对应的横坐标值就是该点所代表细胞的x轴通道的值，所对应的纵坐标值就是该点所代表细胞的y轴通道的值。
环线聚集越多的地方表示此区域细胞密度变化越快，细胞最稀疏的地方还是用散点表示，环线的中央区域代表细胞聚集的中心
流式等高线图比流式散点图更能直观地体现细胞的分群。
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