qpcr原理及应用是什么？

一、原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

1、 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2、 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3、 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链；

重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

二、应用

1、基因表达分析：例如结核分岔杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是一种生长相当缓慢的细菌，传统培养及鉴定一般需要花数周时间。

2015年时Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己发展的real time PCR检测mpt64，直接检测病人痰液中的结核分岔杆菌，分析715个检体657个病人，其检测灵敏度（sensitivity）及特异性（specificity）分别为90.3%及98.6%。

整个实验流程可以在5个小时内完成，此方法可以用于没有套装试剂（kit）可以使用的实验室。

2、检验生物芯片的结果；

3、siRNA与miRNA诊断；

4、基因型鉴定；

5、饮食分析；

6、兽医微生物检测。

特点

1、荧光实时定量PCR的基本原理有两个要点：首先是对PCR反应中的每一个循环的反应产物进行实时检测并记录下来；

其次，用于检测PCR产物实时检测的荧光染料标记在一段可以与单链PCR产物(模板)特异性杂交的探针上，并且处于淬灭状态，只有当探针与模板特异性结合以后才有可能释放出荧光信号。

2、每一轮循环中PCR的产出量都以荧光信号的形式被PCR仪的光学检测系统记录下来，在某一循环中荧光信号的强度达到预先设定的阈值时，此时的循环数称为CT(Threshold Cycle)，Ct值与起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，达到阈值的循环数就越少，换句话说CT值会越小。

如果要确定量的话，需要做出标准曲线，以Ct值为纵坐标，起始模板数为横坐标作图。在新的MIQE规范中Ct这个惯用的名词被重新定义为Cq值(quantification cycle)。

传统上，PCR的应用包括：

侦测DNA序列变异，像变异红血球，地中海型贫血，致癌基因等；

可以简易地测知染色体的重新组合是否发生或是否有移位；

可以利用已经复制过的目标DNA将基因体DNA，直接进行纯种系的次选殖，不仅可以省略繁复的选殖步骤里面挑选目标纯种系的艰巨工作，同时也可能让我们避开保存基因体重的繁杂工程；

能够借PCR产生足够的DNA，轻易地做直接序列测试；

可以让我们很灵敏地侦测病毒或病原的存在；

利用高度保存的序列作引子，也可以复制多样性的基因，在法医学上或亲子鉴定的应用，非常有帮助；

促进检验的灵敏度，这是PCR最有价值的地方。像痰等含复杂物甚多的检体因能够轻易的处置净化而不再是不受欢迎的检体。像由一根头发也能将所含的基因有效的复制放大来分析DNA，像病理科所保存的石腊标本块，也能应用PCR来作分析，对于古代木乃伊检体，甚至化石或冰封的古代生物的DNA，也能作PCR使绝种的古生物的DNA能够被序列出来。

当然，在性别决定的用途上，聚合酶链反应可以大量衍生出Y染色体探针作为细胞染色体分析所用。

这一项科技同时也可更早期侦测出胎儿遗传性疾病。其最大好处是不会侵犯到胚胎或胎儿，免除了流产、早产的危险。不过，欲将之应用到临床产前诊断，必须先克服如轻易分离出滋养层母细胞及辨别其是否为前次妊娠残留的滋养母细胞等难题。

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