一、SDS-PAGE电泳所用溶液：
1）30 %聚丙烯酰胺溶液 (100 mL)
丙烯酰胺 (Arc) 29 g
N,N’-亚甲双丙烯酰胺 (Bis) 1 g
用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放
丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。
2）5×Tris-甘氨酸缓冲液 (1 L)
Tris碱 15.1 g
甘氨酸(电泳级) 94 g
10 %SDS 50 mL
使用时稀释5倍使用
3）2×SDS凝胶加样缓冲液(10mL)
0.5 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 2 mL
10％(W/V)SDS 4 mL
甘油 2 mL
β-巯基乙醇 1.0 mL
(DTT（二硫苏糖醇） 0.31g)
溴酚兰 0.02g
双蒸水 0.5 mL
室温存放备用
4）考马斯亮蓝染色液
考马斯亮蓝R-250 （G-250） 1.0 g
甲醇 450 mL
冰醋酸 100 mL
ddH2O 450 mL
0.2g考马斯亮蓝R250+84mL 95％乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用
5）考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性）
甲醇 100 mL
冰醋酸 100 mL
ddH2O 800 mL
医用酒精：冰醋酸：水=4.5：0.5：5(V：V：V)
二、SDS-PAGE所需溶液:
A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶于去离子水中，定容至100mL(20mL)，加热至68℃助溶。E液——10％过硫酸铵：5g(0.5g)过硫酸铵，溶于50mL(5mL)去离子水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。
F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存。
三、配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液
表1.配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液成分 |
配制不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积/mL |
|||||||
5 |
10 |
15 |
20 |
25 |
30 |
40 |
50 |
|
10 %胶 | ||||||||
水 |
1.9 |
4.0 |
5.9 |
7.9 |
9.9 |
11.9 |
15.9 |
19.8 |
30 %丙烯酰胺混合液 |
1.7 |
3.3 |
5.0 |
6.7 |
8.3 |
10.0 |
13.3 |
16.7 |
1.5 mol/L Tris(pH8.8) |
1.3 |
2.5 |
3.8 |
5.0 |
6.3 |
7.5 |
10.0 |
12.5 |
10 % SDS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
10 % 过硫酸铵 |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
TEMED |
0.002 |
0.004 |
0.006 |
0.008 |
0.01 |
0.012 |
0.016 |
0.02 |
|
12 %胶 | ||||||||
水 |
1.6 |
3.3 |
4.9 |
6.6 |
8.2 |
9.9 |
13.2 |
16.5 |
30 %丙烯酰胺混合液 |
2.0 |
4.0 |
6.0 |
8.0 |
10.0 |
12.0 |
16.0 |
20.0 |
1.5 mol/L Tris(pH8.8) |
1.3 |
2.5 |
3.8 |
5.0 |
6.3 |
7.5 |
10.0 |
12.5 |
10 % SDS |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
10 % 过硫酸铵 |
0.05 |
0.1 |
0.15 |
0.2 |
0.25 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
TEMED |
0.002 |
0.004 |
0.006 |
0.008 |
0.01 |
0.012 |
0.016 |
0.02 |
|
表2. 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶所用溶液 | ||||||||
成分 |
配制不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积/ml |
|||||||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
8 |
10 |
|
水 |
0.68 |
1.4 |
2.1 |
2.7 |
3.4 |
4.1 |
5.5 |
6.8 |
30 %丙烯酰胺混合液 |
0.17 |
0.33 |
0.5 |
0.67 |
0.83 |
1.0 |
1.3 |
1.7 |
1.5 mol/L Tris(pH6.8) |
0.13 |
0.25 |
0.38 |
0.50 |
0.63 |
0.75 |
1.0 |
1.25 |
10 % SDS |
0.01 |
0.02 |
0.03 |
0.04 |
0.05 |
0.06 |
0.08 |
0.1 |
10 % 过硫酸铵 |
0.01 |
0.02 |
0.03 |
0.04 |
0.05 |
0.06 |
0.08 |
0.1 |
TEMED |
0.001 |
0.002 |
0.003 |
0.004 |
0.005 |
0.006 |
0.008 |
0.01 |
关键是AP的使用,AP只是起到引发反应的作用,加入极少量即可,一般是几个微升,千万不要加多,否则凝固速度过快,来不及灌胶就会凝固,即使能来得及灌胶,制出凝胶也是不均匀的.而且AP要在最后加入,如果配胶之后无法及时灌制,就不要加AP了,到灌胶之前再加入AP混匀.
欢迎分享，转载请注明来源：优选云
微信扫一扫
支付宝扫一扫
