PCR基本原理与过程_备孕

变性-退火-延伸（图1）。

PCR中DNA的合成过程均以两个引物特异性结合处为起点。

引物通常是分别取自靶DNA序列两条链的3’端相向的长度在16~25nt的单链DNA片段，即引物头是5’，尾是3’。引物自身为靶DNA一端的互补序列，最终成为产物的组成部分。

耐热的DNA聚合酶 。在已发现的耐热DNA聚合酶中， Taq pol的活性最高，达200000U/mg，反应的最适温度为75-80℃，此时延伸速率达150-300个核苷酸/（秒·酶分子）。该酶具 5’->3’外切酶活性 ，不具3’->5’外切酶活性，故其不具Klenow酶的校对功能，在扩增过程中引起碱基错配概率大大增加，概率约1/300-1/18000，在经过25轮扩增后，扩增产物的序列中平均每400个碱基就有一个与原始序列不同。 Taq pol具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶的活性（非模板依赖的聚合活性），特别对dATP的聚合能力最高，利用这一特性，我们可以构建dT-载体克隆dA尾的产物。同样，利用Klenow酶可以去除3’尾巴，生成平末端的产物。除 Taq pol，人们还陆续发现和获得了其他几种耐热DNA聚合酶，如 Th DNA聚合酶、 Vent DNA聚合酶、 Sac DNA聚合酶以及修饰 Taq pol聚合酶等。

延伸温度与时间 。尽管 Taq pol在75-80℃时活性最高，通常采用的延伸温度为72℃，此时的碱基掺入率约35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。通常扩增1kb以内的DNA片段延伸1min即可，而当代增序列长达3-4kb时，则需延长3-4min；然而当扩增小于150bp的片段时则可以省略延伸步骤，因为在退火温度下 Taq pol的活性已足以完成靶序列的合成。通常PCR最后一轮循环中可以适当将延长时间延长至4~10min，以使PCR反应完全提高扩增产量。在实际操作中，应注意前几轮循环的延伸时间要足够，以使靶序列延伸完全从而提高PCR反应的特异性。此外当待扩增DNA浓度较低时，由于碱基掺入率较低，可适当的延长反应延伸时间。

PCR终产物 分为复杂产物和长度特异产物两部分（图2）。 长度特异产物 是长度严格限定在两个引物链的5’端之间，是特异的目标片段。 复杂产物片段 是以包含有目标序列的初始DNA片段为模板所合成的PCR产物，其5’端为引物序列，而其3’端则远超出另一引物的结合区，以及以这样的DNA链为模板，另一引物结合并延伸形成的一端为双链特异产物部分，另一端为单链的复杂PCR产物。形成复杂产物片段的原因是：新合成的两条DNA链5’端分别是两引物的5’端，是固定不变的，而3’端则没有固定的止点，长短不一（其止点与模板长度、PCR延伸设定时间有关）。长度特异性产物因扩增长度一致（反应到目的片段的最后一个碱基即停止），而呈指数倍性（2 n ）增加。复杂产物片段以算数倍数（2n）增加，且有多种长度类型，导致每个特定分子质量的复杂产物片段的拷贝数很少，相比长度特异性产物其在PCR总产物中几乎可以忽略不计。这使得PCR的反应产物无需再纯化，就能保证足够的纯度用于随后的分析与检验。

PCR产物量 可用 P=N×(1+E) n 计算。P代表PCR产物的拷贝数，E代表平均每个热循环的PCR扩增效率，N代表起始模板拷贝数，n代表热循环次数。平均扩增效率理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。产物增长整体呈现“指数-线形-平台”模式（图3）。初期，因DNA聚合酶活力足、dNTP底物充足，模板浓度低而自身复性少，PCR扩增效率非常接近100%，产物呈现“指数”增长模式。随反应进行，受DNA聚合酶活力下降等原因，PCR效率接近0，最终停止反应而进入平台期。绝大多数情况下，经过 35 个循环，PCR扩增都将进入到平台期。

[1] 王廷华, 刘佳, 夏庆杰. PCR理论与技术[M]. 第三版. 背景:科学出版社, 2013:1-22.

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)。

n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

注意事项

首先是确定的总体积，可以选择10ul, 20ul, 50ul等。

其次是根据mix，算出总体积中mix使用的体积。

根据自己提取或者逆转录得到的DNA浓度，以及一次pcr反应所使用模板的量，计算出DNA的体积。

根据引物浓度以及引物使用的终浓度，计算出引物使用的量。

最后用总体积减去上面几部分的体积，得到的就是水的体积。

pcr原始数据包括原始图片，甚至还有荧光定量（qRT-PCR）的原始数据。

还有的机构要求有溶解曲线，扩增曲线，没有经过任何修饰的免疫组化、免疫荧光图片。其实在行内不论杂志社还是审稿人都对论文原始数据的重视度高了很多。