一、常规PCR
利用DNA分子会在体外95°高温时会发生变性解旋变成单链，然后降温到60°C左右时引物会与单链DNA按碱基互补配对原则结合，接着再升高温度到72°C左右，即DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶会沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成相应的互补链，如此循环往复以达到DNA分子扩增的目的，常规PCR技术无法实现精确定量。
二、实时荧光定量PCR
如要对DNA、RNA样品进行精确定量研究，就需要采用实时荧光定量PCR，根据检测实时荧光PCR产物的方式不同，实时荧光定量PCR主要有DNA结合染料法、基于探针的化学法、淬灭染料引物法等类型。
1. DNA 结合染料法
原理 ：应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。
应用于核算定量和基因表达验证。
优缺点： 它们的优点是可以对任何双链DNA 进行定量，不需要探针，具有相对高的灵敏度和可靠性，并且成本低，简单易用，缺点是它们能在反应中结合所有的DNA双链，其中包括在PCR过程中产生的引物二聚体或其他非特异产物。
染料法一般使用的是SYBR Green I染料，这是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料，不会与单链DNA结合，并且在游离状态下几乎无荧光，只有与双链DNA结合才会发出荧光，因此将PCR扩增产生的双链DNA数量与荧光强度直接关联，产生实时监测的效果。
2. 基于探针的化学法
原理： 应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物；依赖荧光能量共振传递检测特异性扩增产物。
应用于核酸定量、基因表达验证、等位基因鉴别、SNP分型、病原体和病毒检测、多重PCR。
优缺点： 探针法的鉴别能力远远大于DNA结合染料法，因为它们只与目的产物结合，从不与引物二聚体或其他非特异产物结合，缺点是它的合成价格高。
探针法中最常用的TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端，PCR扩增时在加入引物的同时加入探针，探针完整时，荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，从而检测器可以接收到荧光信号。
3. 淬灭染料引物法
原理： 采用荧光标记引物扩增，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中，依赖荧光能量共振传递。
应用于核酸定量、基因表达验证、等位基因鉴别、SNP分型、病原体和病毒检测、多重PCR
优缺点：探针和目标片段的特异性结合产生荧光信号，因此减少了背景荧光和假阳性，还可进行多重PCR扩增，缺点是原料成本价格高
三、实时荧光PCR仪
实时荧光PCR系统包括热循环仪，用于荧光激发的光学系统以及用于收集荧光数据和管理分析的计算机软件，数据通过实时分析软件以图表的形式显示。
PCR 作为现代生物学研究的一种常用方法，具有特异性高、灵敏度高、 简便节约、经济的优点；但是它最大的缺点是对不同的片段条件不同，所以 很难掌握，而且必须要得到目的基因片段。 RFLP 这种方法比较稳定，但 RFLP 实验操作繁琐，检测时间长，成本 较贵，不太适合大规模的分子育种。 PAPD 相对 RFLP 来说，更加省时省力，不需要进行 DNA 多种酶切、 转膜以及探针的制备等多个步骤， 但是它不能用来测定多态性是由父本还是 母本产生的，而 RFLP 这种技术可以做到，而且 PADA 这项技术源于PCR 技术。欢迎分享，转载请注明来源：优选云
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