载体上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下, 载体和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在二者融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。
蓝白斑筛选的机理
由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。
在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。
--蓝白斑筛选过程中，T载体:DNA=1:4,DNA为PCR纯化产物，--如果是摩尔比没什么问题。其实只要目的片段摩尔数高于载体就会有很好的结果。但是如果产物量太大，则会有不良的效果。根据你的问题
1：检测纯化产物。出了问题后纯化产物一定要走电泳查看，确认回收效率。
2：连接的产物量不用太大。3000bp的T载体如果用25ng，你的643bp产物用10~30ng足够了，这个量在凝胶上只是明确的条带而已，不会很亮。
3：检测感受态：感受态细胞如果是自己做的，也许会有杂菌。买来的也存在一定的几率。做一个空转对照，确认感受态不会有问题。
4：休克温度：42度即可，没必要45度。45秒没问题，实际上30~90秒都可以，我一般用45秒。
5：连接：4度过夜已经足够，除非你的片段很长。
6：蓝白斑筛选：有可能淡蓝色的蓝斑是你需要的克隆，如果你的克隆浅蓝色的斑很多，更可能是这样。一般效率高的话只有少于10%的蓝斑，效率一般则可能超过半数蓝斑甚至更多。
7：生长速度：关于生长速度你的概念是错误的，数百道数千bp的插入克隆生长速度不会差太多，不可以此作为依据。即使你转纯化的质粒克隆也会不一样大小。但是有插入的克隆会略略慢一点点。
8：再确认一下载体吧。
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