脂肪检测方法可用索式提取法。
一、索式提取法(经典方法)
1、原理:
样品经前处理后,放入圆筒滤纸内,将滤纸筒置于索式提取管中,利用乙醚或石油醚在水浴中加热回流,使样品中的脂肪进入溶剂中,回收溶剂后所得到的残留物,即为脂肪(粗脂肪)采用这种方法测出游离态脂,此外还含有磷脂、色素、蜡状物、挥发油、糖脂等物质,所以用索氏提取法测得的脂肪为粗脂肪。
2、 适用范围与特点
索氏提取法适用于脂类含量较高,结合态的脂类含量较少,能烘干磨细,不宜吸湿结块的样品的测定。此法只能测定游离态脂肪,而结合态脂肪无法测出,要想测出结合态脂肪需在一定条件下水解后变成为游离态的脂肪方能测出。
二、实验操作流程
1、滤纸筒的制备
将滤纸剪成长方形8×375px ,卷成圆筒,直径为150px,将圆筒底部封好,最好放一些脱脂棉,避免向外漏样。
2、称取样品,将样品烘干磨细,称取一定量与纸筒封好上口,最好用测定水的样品。
3、索式抽提器的准备
索氏抽提器由三部分组成,回流冷凝管、提取管、提脂瓶组成。提脂瓶在使用前需烘干并称至恒重。其它要干燥。
4、抽提
将装好样的纸筒放入抽提管 , 倒入乙醚,乙醚的量从提取管加入,加入的量为提取瓶体积的2/3 接上冷凝装置,在恒温水浴中抽提,水浴温度大约为55℃左右,可用滤纸检验,理论值抽提6-8小时,实际值3-4小时,但也根据样品性质来决定。
5、回收乙醚
当乙醚在提取管内即将虹吸时立即取下提取管,将其下口放到乙醚回收瓶内,使之倾斜,然后将提取瓶放到100-150℃烘箱烘至恒重。
6、计算
脂肪%= (W2-W1)/W x 100,W2——瓶和样品重(g)W1——瓶子重量(g) W——样品重量(g),或:脂肪%=(抽提后滤纸与样品重量—抽提前滤纸重量)/样品重量 × 100,滤纸筒应事先放入烧杯与100-105℃烘箱烘至恒重。
检验脂肪的试剂是苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染液,苏丹染液是鉴别脂肪的染液因为脂肪和苏丹染液有比较强的亲和力,苏丹3遇脂肪变橘黄色,苏丹4遇脂肪变红色即萃取原理。从培养皿中选取最薄的切片,用毛笔蘸取放在载玻片中央;在花生子叶薄片上滴2-3滴苏丹Ⅲ染液,染色3min,如果用苏丹Ⅳ染液,染色1min;用吸水纸吸去染液,再滴加1-2滴体积分数为50%的酒精溶液,洗去浮色;用吸水纸吸去花生子叶周围的酒精,滴一滴蒸馏水,盖上盖玻片,制成临时装片。
检测脂肪的方法:苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ染液可用于脂肪的鉴定。 苏丹3 (又写作苏丹Ⅲ) 黄光油溶红,分子式:C6H5.N:N.C6H4.N:N.C10H6OH 分子量:352。40 棕色,叶片状 熔点:195摄氏度 脂肪和苏丹染液有比较强的亲和力,苏丹3遇脂肪变橘黄色。(即萃取原理) 适合用于生物脂肪材料的鉴定,可在光学显微镜下看到被染成橘黄色的小粒。 苏丹是鉴别脂肪的染液,由NAOH CU(SO)4组成. 苏丹III(IV)可以将脂肪染成橘黄色(红色)。 苏丹Ⅲ是弱酸性染料,呈红色粉末状,易溶于脂肪和酒精(溶解度为0.15%)。苏丹Ⅲ是脂肪染色剂。 具体步骤如下: 取材:取一粒浸泡过的花生种子,去掉种皮。 切片:用刀片在花生子叶的横断面上平行切下若干薄片,放入盛有清水的培养皿中待用。 制片:从培养皿中选取最薄的切片,用毛笔蘸取放在载玻片中央;在花生子叶薄片上滴2~3滴苏丹Ⅲ染液,染色3min(如果用苏丹Ⅳ染液,染色1min);用吸水纸吸去染液,再滴加1~2滴体积分数为50%的酒精溶液,洗去浮色;用吸水纸吸去花生子叶周围的酒精,滴一滴蒸馏水,盖上盖玻片,制成临时装片。 观察:在低倍显微镜下找到花生子叶最薄处,移到视野中央,将物象调节清楚;换高倍显微镜观察,视野中央被染成橘黄色的脂肪颗粒清晰可见(如果为苏丹Ⅳ则脂肪颗粒被染成红色)。检测淀粉:取少量样品,滴加适量碘液,变蓝就含有淀粉。
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