为什么要进行革兰氏染色实验？

注意事项

1、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。

2、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。

3、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。

实验流程

1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用马克笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。

2、涂片

液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5厘米左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2毫米左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。

3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。

4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2－3次固定（以不烫手为宜）。

5、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1分钟。

6、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。

7、媒染：滴加1滴碘液，染1分钟，水洗。

8、脱色：吸去残留水，连续滴加95％乙醇脱色20－30秒至流出液无紫色，立即水洗。

9、复染：滴加蕃红复染3－5分钟，水洗。至此，革兰氏染色结束。

革兰氏染色法，是将所有细菌区分为革兰氏阴性菌（G-）和革兰氏阳性菌（G+）两大类，是细菌学中最为常用的鉴别染色法。这种染色的方法能够将细菌分为阴性和阳性，主要认为革兰氏颜色染色是基于细菌细胞壁特殊化学组分进行染色的。

染色原理，主要是通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细菌细胞壁内形了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，随后再用95%的乙醇进行脱色即可。

革兰氏染色法，是指细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法，这种染色法是由丹麦的医生革兰氏于1884年所发明的，最初其是用来鉴别肺炎球菌与克雷伯肺炎菌。革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色及复染等四个步骤。未经过染色的细菌，由于其周围的环境折光率差别较小，故在显微镜下难以进行区分。

但是，只要经过染色后，阳性菌会呈现出紫色，阴性菌呈现的则是红色，并且还能够清楚的看到细菌的形态，排列及其某些结构的特征，从而可以轻松地进行分类鉴定。

革兰氏染色法的重要意义是：

革兰氏染色法不仅用来观察细菌的形态，而且它还是细菌鉴定的重要方法，

微生物的细胞小且透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

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