构。
即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，分子式为C16 H15 N5 ·2C3 H6 O3 ，分子量457.48。DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜荧光显微镜")观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) 。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。
DAPI 是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。它结合到双链DNA小沟的AT碱基对处，一个DAPI分子可以占据三个碱基对的位置。结合到双链DNA上DAPI分子的荧光强度提高大约20倍，常用与荧光显微镜观测，根据荧光的强度可以确定DNA的量。另外，因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。单独DAPI的最大吸收波长为340nm，最大发射波长为488nm；当DAPI与双链DNA结合时，最大吸收波长为364nm，最大发射波长为454nm（10 mM Tris pH7.0，100 mM NaCl，10 mM EDTA），其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度只有与DNA结合的荧光强度的1/5，其发散光的波长范围约在500nm左右。
利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。
荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。但是当吸收强度较大时，可能发生双光子吸收现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发生。当辐射波长与吸收波长相等时，即是共振荧光。
常见的例子是物质吸收紫外光，发出可见波段荧光，我们生活中的荧光灯就是这个原理，涂覆在灯管的荧光粉吸收灯管中汞蒸气发射的紫外光，而后由荧光粉发出可见光，实现人眼可见。
扩展资料：
许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：
1、异硫氰酸荧光素（FITC）：为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。其主要优点是：人眼对黄绿色较为敏感；通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
2、四乙基罗丹明（RB200）：为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
3、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
4、藻红蛋白（R-RE）：本品为无定形，褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸引光波长为565nm，最大发射光波长为578nm，呈明亮的橙色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。
参考资料来源：百度百科——荧光
又到了高校硕博生撸起袖子加油发论文的季节，生信类文章作为一种短平快的手段受到广大科研者的喜爱。我在pubmed中简单用“TCGA”关键词统计了近十年的SCI发表情况，发现从2010年开始生信SCI成指数性增长由年15篇增加到2700多。令人惊叹，2020年截止当前已经发表1212篇。管中窥豹，如此海量的生信文章，如何异军突起荣获审稿人青睐？近来有不少人抱怨，纯生信投稿杂志越来越少，投稿杂志风向变动太快，审稿人反馈要功能验证，要求补试验。如此看来，给生信文章加点实验料是生信类SCI大势所趋。那么各组学筛选的标记物实验验证的方法有哪些？我本期将给大家奉上多种组学的标记物实验验证方法，供大家参考。
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为了方便大家快速理解，我查阅大量资料以文字加图片的形式板块化呈现常见的各组学方案及简明实验步骤，本期分享基因组学、蛋白组学、代谢组学以及转录组学4个组学的标记物检测方法，废话少说，直接上干货。
一、基因组学marker验证实验
1. 基因表达
逆转录定量PCR（qRT-PCR）是在样品量少或者非常珍贵的情况研究基因表达的模式。这种方法主要的优点是范围宽、敏感性高、精确度高，无PCR后处理步骤，避免了交叉污染，且产出率高，可以进行多重检测等。具体是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入一个荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比增强。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化检测产物量变化，最终得到一条荧光扩增曲线。实验思路见参考文献[1]。
实验材料
新鲜、冰冻的组织、细胞，新鲜、冷冻的血液或血浆等
基因表达量的检测方法还包括：PCR[2]、RT-PCR[3]。
2. 甲基化 检测
甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）是一种灵敏度高，且不受限制酶限制的DNA甲基化检测技术。通常是设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。实验思路见参考文献[4]。
实验材料
新鲜、冷冻、石蜡包埋细胞或组织等
甲基化检测的其他技术还包括：亚硫酸氢盐处理+测序[5]、联合硫酸氢钠的限制性内切酶分析法（COBRA）[6]等。
二、蛋白组学marker验证实验
蛋白质印迹法（免疫印迹试验，Western blot）是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。实验方法应用广泛，是常见的蛋白定性及定量检测方法。实验思路见参考文献[7]。
实验材料
新鲜、冷冻的细胞或者组织
酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。基本原理：使抗原或抗体结合到固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。实验思路见参考文献[8]。
实验材料
新鲜、冷冻的细胞或者组织
免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学。是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片中的蛋白水平检测。其是采用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测，检测相应的目的抗原（或抗体），并进行定位、定性和定量分析。根据标记物的性质检测技术分为：免疫荧光技术、免疫酶技术、免疫金属技术和放射免疫自影法。实验中应用较多的为免疫荧光技术和免疫酶技术。实验思路见参考文献[9]。
实验材料
石蜡包埋的组织、细胞标本以及冰冻组织切片
三、代谢组学marker验证实验
气相色谱质谱联用（GC-MS）：气相色谱法是利用不同物质在固定相和流动相中的分配系数不同，使不同化合物从色谱柱流出的时间不同，达到分离化合物的目的。质谱法是利用带电粒子在磁场或电场中的运动规律，按其质荷比（m/z）实现分离分析，测定离子质量及强度分布，可以给出化合物的分子量、元素组成、分子式和分子结构信息，具有定性专属性、灵敏性高级检测快速等特点。实验思路见参考文献[10]。
实验材料
小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物
液相色谱质谱联用（LC-MS）：具有分析范围广、分离能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快、自动化程度高。其是以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。实验思路见参考文献[11]。
实验材料
不挥发、极性化、热不稳定及大分子（蛋白、多肽、多聚物等）
四、转录组学marker验证实验
1. 表达量验证
qRT-PCR（见基因组学）和Northern blot。
Northern印迹杂交（Northern blot）是用于检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及对其进行定量。原理是在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标志物标记的RNA探针进行反应。应用的文献较少，实验思路见参考文献[12]。
实验 材料
总RNA样品或mRNA样本（RNA容易降解，需要注意保存方法及周期）
灵敏度：qRT-PCR>Northern blot，特异性：Nortern blot>qRT-PCR（上述已说明实验方案）。
2. RNA和蛋白质相互作用
RNA免疫沉淀（RIP）：是将所关注的RNA结合蛋白（RBP）与其结合的RNA一起进行免疫沉淀，鉴定结合转录RNA。可以通过RT-PCR、微阵列或测序检测，是一种基于抗体，用于定位体内的RNA-蛋白质相互作用的技术。实验思路见参考文献[13]。
实验材料
细胞
RNA-pull down：是将RNA进行标记（如生物探针标记）再与胞浆蛋白提取液共同孵育，从而形成RNA-蛋白质复合物，通过SDS-PAGE分离蛋白质，最后通过Western blot或质谱检测蛋白质。用于寻找与目的RNA结合的蛋白。实验思路见参考文献[14]。
实验材料
细胞胞浆蛋白
此外还包括：甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）[13]。
今天的分享就到这里，由于各组学marker验证的方法繁多，本期主要分享常见的方案，期望大家对各组学marker的实验方法有一个简单的认识，基于各组学的后续机制相关探究，还需要加入如细胞功能学实验的细胞增殖、细胞迁移、侵袭、细胞凋亡实验以及动物模型等，这些机制探究的方法大多大同小异，相信大家在阅读相关的文献后很快会发现个中规律~
最后祝大家SCI逢稿必中！
参考文献
1. Liu X, Wang J, Chen M, Liu S, Yu X, Wen F. Combining data from TCGA and GEO databases and reverse transcription quantitative PCR validation to identify gene prognostic markers in lung cancer. Onco Targets Ther. 201912:709‐720. Published 2019 Jan 21. doi:10.2147/OTT.S183944
2. Rodriguez, Rebecca M et al. “The landscape of bacterial presence in tumor and adjacent normal tissue across 9 major cancer types using TCGA exome sequencing.” Computational and structural biotechnology journal vol. 18 631-641. 13 Mar. 2020, doi:10.1016/j.csbj.2020.03.003
3. Zhou F, Liu X, Zuo D, et al. HIV-1 Nef-induced lncRNA AK006025 regulates CXCL9/10/11 cluster gene expression in astrocytes through interaction with CBP/P300. J Neuroinflammation. 201815(1):303. Published 2018 Oct 31. doi:10.1186/s12974-018-1343-x
4. Xie K, Zhang K, Kong J, et al. Cancer-testis gene PIWIL1 promotes cell proliferation, migration, and invasion in lung adenocarcinoma. Cancer Med. 20187(1):157‐166. doi:10.1002/cam4.1248
5. Hu H, Chen X, Zhou C, et al. Aberrant methylation of mutL homolog 1 is associated with increased risk of non-small cell lung cancer. J Clin Lab Anal. 201832(5):e22370. doi:10.1002/jcla.22370
6. Pangeni, Rajendra P et al. “The GALNT9, BNC1 and CCDC8 genes are frequently epigenetically dysregulated in breast tumours that metastasise to the brain.” Clinical epigenetics vol. 7,1 57. 27 May. 2015, doi:10.1186/s13148-015-0089-x
7. Han D, Yu T, Dong N, Wang B, Sun F, Jiang D. Napabucasin, a novel STAT3 inhibitor suppresses proliferation, invasion and stemness of glioblastoma cells. J Exp Clin Cancer Res. 201938(1):289. Published 2019 Jul 5. doi:10.1186/s13046-019-1289-6
8. Wang D, Yuan W, Wang Y, et al. Serum CCL20 combined with IL-17A as early diagnostic and prognostic biomarkers for human colorectal cancer. J Transl Med. 201917(1):253. Published 2019 Aug 6. doi:10.1186/s12967-019-2008-y
9. Liu L, Liu X, Dong Z, et al. N6-methyladenosine-related Genomic Targets are Altered in Breast Cancer Tissue and Associated with Poor Survival. J Cancer. 201910(22):5447‐5459. Published 2019 Aug 29. doi:10.7150/jca.35053
10. Chen H, Pan D, Yang Z, Li L. Integrated analysis and knockdown of RAB23 indicate the role of RAB23 in gastric adenocarcinoma. Ann Transl Med. 20197(23):745. doi:10.21037/atm.2019.11.130
11. Apaya MK, Shiau JY, Liao GS, et al. Integrated omics-based pathway analyses uncover CYP epoxygenase-associated networks as theranostic targets for metastatic triple negative breast cancer. J Exp Clin Cancer Res. 201938(1):187. Published 2019 May 9. doi:10.1186/s13046-019-1187-y
12. Wang XL, Shi WP, Shi HC, et al. Knockdown of TRIM65 inhibits lung cancer cell proliferation, migration and invasion: A therapeutic target in human lung cancer. Oncotarget. 20167(49):81527‐81540. doi:10.18632/oncotarget.13131
13. Chen Y, Peng C, Chen J, et al. WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1. Mol Cancer. 201918(1):127. Published 2019 Aug 22. doi:10.1186/s12943-019-1053-8
14. Liao M, Liao W, Xu N, et al. LncRNA EPB41L4A-AS1 regulates glycolysis and glutaminolysis by mediating nucleolar translocation of HDAC2. EBioMedicine. 201941:200‐213. doi:10.1016/j.ebiom.2019.01.035
15. 高通量测序后的实验验证手段——转录组篇（上）
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