Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
一、原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、试剂准备
1、SDS-PAGE试剂:见电泳实验。
2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml。
3、转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml。
5、膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。
6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H202 1.0μl。
三、操作步骤
（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。
（二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
（三）转移：（半干式转移）
1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。
2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。
3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
（四）免疫反应：
1、用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。
2、加入包被液，平稳摇动，室温2hr。
3、弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。
4、加入一抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部），4℃ 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
5、弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。
6、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用0.01M PBS稀释），平稳摇动，室温2hr。
7、弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。
8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
四、注意事项
1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。
2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。
3、DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。
（二）IHC
免疫组织化学 IHC
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。
免疫组织化学的全过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的制备；5.免疫细胞化学反应以及呈色反应；6.观察结果。
免疫组化基础知识
免疫组织化学的概念：
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的抗体有哪些？
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？
实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。
石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？
石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。
免疫组化常用的染色方法有哪些？
根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。
抗体交叉反应的原因：
指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面：
1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。
2. 共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。
3. 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。
多抗和单抗特性比较：
1.均一性。一种单抗中，每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，只有一种Ig亚类。即单抗是一种纯度很高的均一抗体。而从不同动物，不同时期所得到的多抗，各有不同的化学组成。多抗是多种种类和亚类Ig的混合物。
2. 稳定性。单抗的稳定较差，对PH变化敏感，对热不稳定，提纯过程中易变性，而多抗的稳定性则较好。
3. 特异性。单抗是单一地针对抗原的某一决定簇，所以用它进行血清学反应时，特异性强，敏感性高，一般不发生交叉反应。而多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，所以特异性较差，较易引起交叉反应。
4.重复性。单抗的重复性好，而多抗每批都不一样。
5. 沉淀反应。多抗由于与抗原多价结合容易形成网络样沉淀，而单抗只与抗原结合产生二聚体，不能直接形成抗原抗体沉淀物。
抗体的保存：
抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20℃条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20℃以下可保存3-5年。保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4℃下保存数月。
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目录1 拼音2 简介3 构成4 制剂 4.1 正常免疫球蛋白4.2 特异免疫球蛋白 5 种类6 副作用 1 拼音rén xuè miǎn yì qiú dàn bái
2 简介人血免疫球蛋白（human immunoglobulin）是从健康人血浆中提取出来的具有抗体活性的球蛋白。40年代用电泳将球蛋白按迁移率分为甲（α）、乙（β）及丙（γ）三种，并发现后者含有多种抗体，故免疫球蛋白制剂多被称为“丙种球蛋白”。60年代以后，发现免疫球蛋白有5类（IgG，IgM，IgA，IgE及IgD），而且在电泳中并非都在γ范围（图1），故血制剂“丙种球蛋白”一词渐被“免疫球蛋白”代替。
3 构成IgG在电泳中分布于从α2到γ2的很长一段范围内。它由两对肽链构成： 一对较长，各有420～440个氨基酸残基，称为重链（H）一对较短，各有212～214个氨基酸残基，称为轻链（L）。四条链由共价键和非共价键 （二硫键）连在一起，构成一个分子量约160，000的球蛋白 。肽链由基本单位组成，各基本单位有不同的功能，故又称“功能区”。重链有4个功能区，从N端起依次称为VH，CH1，CH2和CH3轻链有两个功能区，分别称为V2和C2VH和VL的氨基酸序列是高度可变的，故称“可变区”CL、CH1、CH2和CH3变化很少，故称“恒定区”。VH及VL共同构成免疫球蛋白抗体功能部位（与相应抗原结合的部位），因其氨基酸序列高度可变，故可产生不同的抗体专一性。恒定区的各功能单位则决定各类免疫球蛋白的抗原性并具有许多生物活性。因为这部分肽链的氨基酸构造恒定，故各类免疫球蛋白的抗原性和生物活性也是稳定的。
不同的蛋白酶可将IgG水解成不同的碎片。木瓜酶在连接重链的二硫键的前方切断重链，故产生三个碎片：两个Fab及一个Fc。胃酶在二硫键的后方切断重链，故产生两个碎片：F（ab′）2和Fc。Fab及F（ab′）2都有抗体活性，能与相应的抗原结合，但Fab只能结合一个抗原，而F（ab′）2能结合两个抗原。切掉Fc的IgG，失去许多重要的生物活性，成为功能不全的抗体。天然状态的IgG在体内以单体的形式存在，离体后经受某种处理，常形成聚合体。IgG有4个亚类（IgG1、IgG2、IgG3及IgG4），其分子结构、抗原性和生物活性均有一定区别。IgG还有许多基因型。免疫球蛋白一批制剂常是成百、成千甚至成万个供者的血浆混在一起制造的，故都含有各种亚类和基因型。
免疫球蛋白在浆细胞和B淋巴细胞中合成，然后分泌到淋巴和血液中，最多的是IgG，约占75%IgA和IgM分别约占15%和10%IgE和IgD只有微量。IgG每天每千克体重合成和代谢约33mg，受到抗原 *** 后还会加速合成。它的半寿期16～29天，平均23天。正常人血浆免疫球蛋白含量个体差异和波动都很大，一般在600～1，600mg/dl之间。先天性免疫缺陷、骨髓干细胞再生不良，或病人接受化疗、放疗，淋巴细胞减少可造成免疫球蛋白缺乏症，但一般不低于200mg/dl。无显著影响。严重缺乏则可使抵抗力降低，容易发生感染。
4 制剂4.1 正常免疫球蛋白
正常免疫球蛋白是从大批混合的健康人血浆或健康产妇的胎盘或胎盘血中提取出来的免疫球蛋白如用后一种原料制造，制品的质量应与用正常血浆制造者相同，不得含有正常血浆所没有的成分 （激素、酶类、胎盘组织蛋白等）。我国用于常规生产的方法为盐析、利凡诺沉淀和冷乙醇法世界上大规模的工业化生产中，以cohn冷乙醇法或其改良法应用最广。我国用胎盘或胎盘后血制造者为5%每支3ml。可加甘氨酸作为保护剂，还可加适宜的防腐剂。液体制剂在2～8℃保存，效期三年。（我国用胎盘或胎盘后血制造者，效期2年半）免疫球蛋白，特别是用胎盘或胎盘后血制造者，在液体状态保存常可发生自然裂解，故最好制成冻干制剂。冻干制剂，一般每支500mg，可在25℃以下的常温保存，效期5年。
4.2 特异免疫球蛋白特异免疫球蛋白的制造方法与正常免疫球蛋白相同，但所用原料为含有特异抗体的血浆。这种血浆可从正常人群中筛选血中含有某种抗体并达到一定滴度的供者或给供者进行人工免疫而获得。
5 种类
（1） 胃酶水解IVIG：用胃酶进行适度的水解，将IgG分解为F（ab′）2及Fc。这种IVIG抗体功能不全，而且与抗原的结合力减弱，更大的缺点是体内半寿期大大缩短（仅1～2天），故已很少应用。
（2）纤溶酶水解IVIG： 纤溶酶对IgG的水解作用与木瓜酶近似，但不完全相同。这类IVIG比胃酶水解者功效较好，半寿期较长，但不如完整的IgG。目前供临床使用的IVIG以这类制剂最多我国用胎盘或胎盘后血制造的IVIG系利用原已含于血中的蛋白酶，在一定条件下使IgG“自然裂解”到一定程度而得，故亦属此类。
（3） pH4 IVIG：这种IVIG的抗体功能基本完整，半寿期比正常IgG略有缩短。目前主要是瑞士红十字会和Sandoz药厂用这种方法生产IVIG。据报告，疗效甚好，副作用很少。
（4） β丙内酯处理IVIG：这种IVIG，分子结构无明显变化，功能基本完整，电泳迁移率略加快，半寿期略缩短（14～17天）据报告，疗效良好，副作用很少。而且，由于经过β丙内酯和紫外线处理，病毒被灭活，故无传播肝炎病毒的危险。西德Biotest药厂用此法生产但迄今未在世界各国广泛应用，主要因为β丙内酯属于“致癌物质”，许多人对其有所顾虑。
（5）磺化IVIG（简称SIVIG）：这种IVIG，抗体功能基本完整，半寿期与正常IgG无显著差别据报告，疗效良好。日本绿十字药厂生产这种IVIG 。
（6） 还原IVIG：用比较温和的还原剂二硫苏糖醇（dithiothreitol）和碘乙酰胺处理IgG，使还原和烷化。据报告，经这样处理的IgG注后24小时由36～45%可以从血清中检出，抗原性没有变化抗体功能基本完整而失去了非特异结合补体的作用半寿期15.5～28.5天，平均22.4天疗效良好，副作用极少。
（7） 高度纯化IVIG：血浆先用气凝胶吸附除去脂蛋白和酶原类物质，再经凝胶过滤除IgM和聚合IgG以及残余的酶原，然后经离子交换层析，使IgG纯度达到99%以上，而且不含聚合体或其他生物活性物质。据报告，疗效良好。瑞典pharmacia药厂用此法生产IVIG。IVIG中不得加任何防腐剂，最好冻干保存，非酶解的IVIG多半加高浓度的糖类为稳定剂以防止IgG在冷冻、干燥或保存过程中发生聚合。
6 副作用（1）制造方法不当或生产过程中质量控制不严，可能携带某些病毒。
（2）正常免疫球蛋白，肌内注射特别是剂量较大时常引起红肿疼痛，但可自行消退，并无妨碍。静脉注射引起“类过敏休克”反应，轻者面潮红或苍白、胸闷或胸痛、呼吸困难、恶心呕吐、血压下降，重者发生休克，甚至引起死亡。故正常免疫球蛋白禁忌静脉注射。反应的机理尚未完全明了，一般认为免疫球蛋白制剂中含有多聚体，后者能非特异地激发补体反应而引起各种症状制剂中也可能含有某些血管活性物质（如pKA，凝血因子XI的降解产物等）。
（3）变态反应： 主要是在IgA缺乏的人中发生。免疫球蛋白制剂中含有IgA，可使IgA缺乏的人致敏，故再次注射时可发生过敏症等变态反应。
功效：
1.预防乙肝
免疫求蛋白有很多种，其中有一种就是肝免疫球蛋白，这种免疫球是我们平时生活中最长听见的一种。专家指出，这种免疫求蛋白的主要作用是预防乙肝病毒感染，现如今已经将这种免疫求制作成药，服用后便可起到预防乙肝的作用。而且乙肝免疫球蛋白来自于经乙肝疫苗免疫的健康人血浆，经过高科技的提取以及灭活病毒，冻干制成高效价的乙肝免疫球药品。专家提示，如果服用免疫球蛋白的话，则应该在医生的指导下服用，这样才能起到预防乙肝的作用。尤其是一些没有注射乙肝疫苗的患者，更应该及时服用这种防感染药物。
2.阻断母婴传播
专家指出，免疫球蛋白还具有清除游离hbv的作用，也就是，阻断母婴之间乙肝感染等各种感染病的作用。同时专家特别提醒一些肝表面抗原阳性的孕妇，最好是从怀孕孕28周时间开始，每个月都应该注射一针乙型肝炎免疫球蛋白，这样可以有效的阻断乙型肝炎病毒在子宫内的传播以及感染，从而保护胎儿的健康以及健康生长发育。同时新生儿在出生后也应该及时注射乙肝高效免疫球蛋白，除此之外还应该同时接种乙肝疫苗，这样才可以更好的阻断乙型肝炎的母婴传播，并且还具有提高婴儿的免疫力的作用。
3.清除游离hbv
免疫球蛋白还具有预防以及防止感染的作用，并且经过大量研究发现，免疫球蛋白是可以用于具有感染hbv的乙肝患者的。尤其是一些防医务人员以及接触hbv感染人群，还有就是一些血清表面抗原滴度小于10iu/l的人群。比如像医生、护士和检验人员等人员，这些工作人员经常会在工作时皮肤破损，如果不慎接触带有乙肝病毒的血液这个时候就很有可能会感染乙肝。因此一旦出现皮肤破损的情况，就应该在12个小时之内给受感染人员注射乙肝免疫球蛋白1支，而等到一个月时间后还应该再重复注射一次，这样才能起到预防的作用。
4.乙肝病毒患者
还有就是其它任何意外接触乙肝病毒的人群或无乙肝保护性抗体的人群，尤其是一些已接种疫苗但尚未产生抗体、保护性抗体不足的乙肝易感人群，在乙肝病毒暴露之前都必须要采用注射乙肝免疫球蛋白的方式，来起到最好的预防作用。
参考资料:中国医学教育网，中国医药学论坛
免疫球蛋白（Ig）指具有抗体（Ab）活性或化学结构，与抗体分子相似的球蛋白。免疫球蛋白是由两条相同的轻链和两条相同的重链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白分为五类，即免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）和免疫球蛋白E（IgE）。
免疫系统由免疫组织、器官、免疫细胞及免疫活性分子等组成。免疫球蛋白是免疫活性分子中的一类，而免疫活性分子包括免疫细胞膜分子，如抗原识别受体、分化抗原、主要组织相容性分子以及一些其他受体分子等；也包括由免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌的分子，如免疫球蛋白分子、补体分子以及细胞因子等。免疫球蛋白是化学结构上的概念。所有抗体的化学基础都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不都具有抗体活性。
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