蛙心灌流实验

[实验目的] 1．学习离体蛙心灌流的实验方法。 2．观察Na、K、Ca三种离子及肾上腺素、乙酰胆碱等因素对心脏活动的影响。 [实验原理] 1．心脏的正常节律性活动需要一个适宜的内环境，内环境的变化直接影响着心脏的正常活动。本实验在蛙心的灌流液内人为地加入一些物质而改变心脏活动的内环境，观察心脏活动有何变化。 2．心肌细胞分类 收缩性 兴奋性 传导性 自律性非自律细胞， 心房肌，心室肌细胞 有 有 有 无自律细胞，p细胞，浦肯野细胞 无 有 有 有快反应细胞：心房肌，心室肌，浦肯野细胞：主要由快钠通道被激活，Na快速内流引发动作电位，去极速度快慢反应细胞：窦房结细胞，房室交界区细胞：主要由慢钙通道被激活，Ca内流引发动作电位，去极速度慢3．心肌细胞的生理特征：电生理特征：自律性，兴奋性，传导性机械生理特征：收缩性影响心肌细胞电生理因素影响心肌细胞兴奋性因素（心室肌细胞） 影响心肌细胞自律性因素（窦房结细胞） 影响心肌细胞传导性因素（房室交界区细胞） 静息电位水平与阈电位水平之间的差距 4期自动除极的速度 结构因素：直径钠通道状态 最大复极电位水平与阈电位水平之间差距 动作电位0期去极速度和幅度 邻近部位膜的兴奋性心肌细胞兴奋－收缩耦联过程所需的Ca要从细胞外液转运，细胞兴奋时，膜上Ca通道开放，因此：细胞外液Ca浓度↑――细胞兴奋时内流Ca↑――心肌收缩力↑反之亦然4．1％KCl： 即134mmol/ L（正常：4mmol／L）轻，中度高钾：细胞外K↑――K与Ca在细胞膜上有竞争性抑制――K抑制细胞膜对Ca转运――进入细胞内Ca↓ ――心肌的兴奋收缩联过程减弱――心肌收缩力↓[K] ↑――膜内外k浓度梯度减小――静息电位绝对值减小――兴奋性↑[K] ↑――细胞膜对k通透性增加――K通道失活V↓――自动去极化V↓――自律性↓[K] ↑――细胞膜对k通透性增加――K外流增加――最大复极电位↑――自律性↓[K] ↑――Ca内流受抑制――0期去极速度和幅度降低――传导性降低重度高钾：[K]↑↑――RP↓――Na通道失活――兴奋性丧失5．2％CaCl2： 即180mmol/L（正常：2mmol／L）细胞膜外Na与Ca有竞争性抑制细胞外液Ca浓度↑――细胞兴奋时内流Ca↑――心肌收缩力↑快反应细胞：高Ca――Na内流抑制――0期去极化速度及幅度下降――传导性↓慢反应细胞： 高Ca――Ca易进入细胞，Ca内流增加――0期去极化速度增加――传导性↑ 6． O. 65％NaCl ： 111mmol／L细胞外Ca↓――2期内流Ca↓――胞浆Ca 浓度↓――心肌收缩↓[Ca] ↓――Ca内流减少――0期去极化速度减慢――传导性↓ [Ca] ↓――Ca不易进入细胞――4期自动除极的速度减慢――自律性↓7：肾上腺素 正性变化肾上腺素与心肌细胞膜上的β1受体结合――心肌细胞和肌浆网膜Ca通透性↑――肌浆中Ca浓度增加――心肌收缩↑使K通道，Na通道，Ca通道都开放，------慢Ca通道-----8：乙酰胆碱 负性变化乙酰胆碱与心肌细胞膜上的M受体结合――心肌细胞膜K通道的通透性↑――促k外流――1：窦房结细胞复极时K外流↑――最大复极电位水平↑――自律性↓2：复极时K外流↑――AP 2,3期缩短――Ca进入细胞内↓――心肌收缩↓乙酰胆碱可直接抑制Ca通道――Ca内流↓――心肌收缩↓[实验对象] 青蛙或蟾蜍[实验器材和药品]1．器材 生物信号采集系统、机械换能器、蛙类手术器械1套、蛙心插管、蛙心夹、试管夹、双凹夹、万能支架、滴管、150ml小烧杯4个、任氏液。2．药品 O. 65％氯化钠、2％氯化钙、1％氯化钾、1：10 000肾上腺素、1，10 000乙酰胆碱等。[实验步骤]1 离体蛙心的制备(1)取1只蟾蜍，破坏脑和脊髓，仰卧固定于蛙板上，用外科剪由剑突处向两锁骨肩峰端呈三角形剪开皮肤，用粗剪刀剪开胸壁，用图钉固定两前肢，用镊子提起心包膜，用眼科剪将其剪开，暴露心脏。(2)在两个主动脉干下各穿两根细线（一根用来结扎腔静脉，另一根用来结扎蛙心插管和主动脉），并将其中一根打一活结备用。(3)将心脏上翻，辨认心房，静脉窦，腔静脉，然后结扎腔静脉。(4) 用左手提起结扎线，右手用眼科剪在左侧主动脉距分叉部3mm处剪一“v”型口。将盛有少量任氏液的蛙心套管(用拇指将套管堵住，以防套管中的任氏液流出)从“v”型口插入动脉球底部，然后稍后撤套管，再将蛙心管尖端转向蟾蜍的背侧及左下方，于心缩期插入心室内。插管如已进入心室，可见管中液面随着心搏而升降，此时即可将预置线的活结扎紧，并固定于插管壁的小钩上。(5) 小心提起套管和心脏，剪断主动脉左右分支；将心脏连同静脉窦一起剪下。(6)吸去管内的血液，并用任氏液反复冲洗心室内的余血，以防血液凝固而影响实验的进行。用连有细线的蛙心夹在心舒期夹住心尖部。（心尖大，夹组织少，不易损伤心脏） 2．实验装置 将蛙心插管用试管夹固定于支架上，蛙心夹的连线连接在机械换能器上。换能器的输出线与计算机的“输入”端相连。打开计算机，进入“蛙心灌流”界面。调节实验参数，开始记录心脏收缩曲线。 3．观察项目(1)记录心脏在仅有任氏液时的收缩曲线，观察心率及收缩幅度，作为正常对照。(2)吸去管内的任氏液，换以等量0.65％Nacl，观察并记录心跳的变化。(3)等量任氏液换洗，待心跳恢复正常后，加入2％Cacl 1—2滴，记录观察心跳的变化。(4)等量任氏液换洗，待心跳恢复正常后，加入l％Kcl 1～2滴，记录观察心跳的变化。(5)等量任氏液换洗，待心跳恢复正常后，加入1：l0 000肾上腺素1～2滴，记录并观察心跳的变化。(6)等量任氏液换洗，待心跳恢复正常后，加入l：10 000乙酰胆碱1～2滴，记录并观察心跳的变化。4．实验结果的处理 对正常心脏收缩曲线和各项实验所得结果均应在实验时进行标记，然后整理并附在实验报告单上，对实验结果进行理论上的解释。 收缩幅度 收缩频率正常 KCL ↓ ↓CaCl ↑ ↑NaCl ↓ ↓ E ↑ ↑Ach ↓ ↓ [注意事项]1．蛙心夹应一次性夹住心尖，不宜夹多次，以免损伤心脏。2．蛙心夹与换能器簧片的连线应呈一定的倾斜度，以防溶液滴入换能器。3．当各项实验效果明显后，应及时将插管内的溶液吸出，至少用任氏液反复冲洗2～3次，待心跳恢复正常后，再进行下一项实验。4．各种溶液的滴管应分开，不要混用。5．在实验过程中，基线的位置、放大倍数、扫描速度一经调好后不要再变动。6．在各项实验中，蛙心插管内灌流液的液面高度应始终保持一致，以保证心脏固定的负荷。7．每一项实验，均应先记录一段正常对照曲线，然后再加入药液并记录其效应。8．肾上腺素：加2-3滴，可多次使用 乙腺胆碱：必须最后一次滴加 NaCl：全换 其余：从一滴加起[思考题]1．给人体快速静脉注射钾离子，会有什么样的结果?2．蛙心插管内灌流液是心脏的什么负荷?3．正常体内肾上腺素、乙酰胆碱等化学物质来自何处?

1、钙离子、肾上腺素、乙酰胆碱对离体蛙心活动有何影响？为什么？高钙可见蛙心收缩力增强，但舒张不完全，以致收缩基线上移。在钙离子浓度较高的情况下，心脏会停止在收缩状态，称为“钙僵”。心肌的舒缩活动与心肌肌浆中的钙离子浓度的高低有关。心肌肌浆网不发达，储钙能力差，易受细胞外钙离子浓度高低影响，当钙离子浓度升高至10-5m水平时，作为钙受体的肌钙蛋白结合了足够的钙离子，这就引起肌钙蛋白分子构型的改变，从而触发肌丝滑行，肌纤维收缩。当肌浆中钙离子浓度降哗长糕短蕹的革痊宫花至10-7m时，钙离子与肌钙蛋白解离，心肌随之舒张。用高钙任氏液灌注蛙心，使得肌浆中的钙离子浓度不断升高，钙离子与肌钙蛋白结合数量不断增加，甚至达到只结合不解离的程度，于是，心肌出现钙僵。滴加肾上腺素后，可见蛙心收缩增强，心脏舒张完全，心博曲线幅度明显增大。因为肾上腺素使心肌收缩能力增强。机理为肾上腺素与心肌细胞膜上的β受体结合，提高心肌细胞和肌浆网膜钙离子通透性，导致肌浆中钙离子浓度增高，使心肌收缩增强。另外，肾上腺素还有降低肌钙蛋白与钙离子亲和力，促使肌钙蛋白对钙离子的释放速率增加；提高肌浆网膜摄取钙离子的速度，刺激钠-钙离子的交换，使复极期向细胞外排出钙离子的作用加速。这样，使心肌舒张速度增快，整个舒张过程明显加强。滴加乙酰胆碱后，可见蛙心收缩减弱，收缩曲线基线下移，心率减慢。最后，心跳停止于舒张阶段，出现类似高钾时的变化。因为乙酰胆碱使心肌的收缩能力减弱。机理为乙酰胆碱与心肌细胞m受体结合，一方面提高心肌细胞膜钾离子通道的通透性，促使钾离子外流，将引起（1）窦房结细胞复极时钾离子外流增多，最大复极电位绝对值增大；ik衰减过程减弱，自动除极速度减慢。这两方面因素导致窦房结自律性降低，心率减慢。（2）复极过程中钾离子外流增加，动作电位2、3期缩短，钙离子进入细胞内减少，使心肌收缩力减弱；另一方面乙酰胆碱可直接抑制钙离子通道，减少钙离子内流，使心肌细胞收缩减弱。2.心室肌动作电位的分期和产生机制？（1）0期（去极化过程）快钠通道激活，大量钠离子内流（2）1期（快速复极初期）钾离子外流（3）2期（平台期）钙离子内流和钾离子外流处于相对平衡的状态（4）3期（快速复极末期）l型钙通道失活关闭，钙离子内流停止，而钾离子外流又进行性增加（5）4期（恢复期）

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