哺乳动物细胞蛋白表达纯化服务实验报告案例

本案例基于pAZV5分泌表达体系，使用基因合成的方法构建pAZV5表达载体，瞬时转染HEK293悬浮细胞，通过SDS-PAGE和 Western Blot检测蛋白的表达情况，扩大培养收集细胞上清并通过Ni柱的亲和纯化获得目的蛋白。

一、实验设计 

我们分析客户提供的Target-Gene序列，整个蛋白序列呈亲水性，自身不带信号肽序列，因此我们设计思路为：

1.1、以客户的基因序列翻译的蛋白序列为源模板，通过密码子优化一套最适宜HEK293细胞系的基因序列。

1.2、推荐客户使用钟鼎生物的自主载体pAZ-V5载体来进行实验，利用载体自带的V5信号肽序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外，为了保持蛋白的N端活性，我们在C端添加6XHis-Tag便于重组蛋白的检测和亲和纯化。

依据上述设计思路，以基因合成的方式构建pAZ-V5表达质粒，经过测序和酶切验证无误后，挑取无内毒素的质粒。转染200ml HEK293细胞，通过western blot检测蛋白表达情况，确认蛋白表达情况，再通过Ni-resin亲和纯化获得80%以上目的蛋白。

二、试剂和耗材

名称 公司 名称 公司

DMEM 高糖、DMEM低糖、胎牛血清、胰蛋白酶、opti SFM、转染试剂Invitrogen（Gibco）无内毒素质粒中提试剂盒、LAL内毒素检测试剂、基础化学试剂、低熔点琼脂糖Sigma公司

抽提试剂盒Axygen公司PCR试剂盒IO-RAD公司

六孔板、细胞培养瓶、离心管corning公司PCR反应管Fisher公司

DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒AXYGEN公司Agarose上海基因公司

中性红碧云天生物公司其它试剂均为国产分析纯

二、主要实验仪器

仪器名称 公司 仪器名称 公司 仪器名称 公司

Allegra 21R 台式高速冷冻离心机美国BECKMAN公司台式高速离心机德国SORVAL公司Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统美国BIO-RAD公司

PTC-200基因扩增仪美国MJ Research公司320-S pH计美国Mettler Toledo公司AR5120电子天平美国AHOM S公司

MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪美国Amersham Pharmacia公司雪花状制冰机日本SANYO公司JY92-2D超声波细胞粉碎机中国新芝科器研究所

蛋白核酸检测仪南京大学普阳科学仪器厂NANODROP2000美国Thermo公司超净工作台中国苏净集团

四、蛋白性质分析

4.1 客户提供原始基因序列

GTGGGGTGCT******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容，不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******CTTCTCCCTT

4.2 编码的蛋白序列如下（理论分子量41.18KD，理论等电点PI6.73）

GCSVDFSK******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容，不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******TAGSTDHMDHFSL

4.3 稀有密码子序列分析如下图所示（红色：使用频率低于10% 灰色：使用频率低于20%，绿色为正常频率密码子）

4.4 蛋白序列跨膜及亲疏水性分析

4.5 信号肽预测

综上所述：

1、蛋白理论分子量为 41KD，属于正常分子量范围，较适宜表达。

2、通过对基因密码子使用频率的分析，如果以293细胞为表达宿主，基因序列上使用频率低于20%的密码子X个，使用频率低于10%的密码子X个，优化后通过基因合成方式获得目的基因。

3、通过对蛋白的跨膜结构和亲疏水性分析，蛋白整体呈亲水性，但从473AA之后，蛋白存在典型的跨膜结构，建议去除后表达以提高成功率。

4、目的蛋白自身无信号肽，添加GP67信号肽便于蛋白分泌表达。为了纯化方便，考虑在C端添加His标签。

五、实验方法及实验结果

5.1 pAZ-V5表达质粒构建

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成target-gene基因，双酶切连接至pAZ-V5载体的Afl II和Xba I之间；将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如下所示，单划线区为目的基因基因区域。紫色区域为酶切位点，黄色区域为v5信号肽，绿色区域为6XHis标签；

T A G C A G A G C T C T C T G G C T A C T A G A G A A C C C A C T G C T T A C T G G C T T A T C G A A A T T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G A G A C C C A A G C T G G C T A G C G T T T A A A C T T A A G C * * X 3 * * * * N N N N N N---略-----N N N N N N * * T G A G T A G G C A C C A C C A C C A C C A C C A C T G A C T C T A G A G G 

5.2 使用Chromas软件查看测序峰图文件，截取部分序列示例如下：

5.3 pAZ-V5载体图如下所示：

表达条件优化

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T7 RNA poly前端需加一个启动子，该启动子的选择依真核表达细胞类型而定，普通细胞用CMV-promoter即可，ES cell 用UBC promoter较好。另外，要分泌到细胞外部，需在外源基因N端加信号肽的序列，因为信号肽经由膜中蛋白质形成的孔道到达内质网内腔，随即被位于腔表面的信号肽酶水解，由于它的引导，新生的多肽就能够通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞外。保险起见，最好再加上出核信号。大概就是这些啦。

首先请上NCBI BLAST搜索之(blastp)。或许可以直接查到你研究物种的基因序列。即使没有，有近缘物种的基因序列也是个好的参考，通过比对，选择序列保守区设计引物。

若搜索不到任何信息，就需要通过设计兼并引物。比如你的蛋白质N端序列为

MTAGSR

上游引物即为5'-ATG NNN NNN -3'(参考那个密码子表，和兼并碱基的标法,吾手头没有，记不住额)

下游引物就得反过来，假设蛋白序列为 N-XX-C 其编码DNA为 5'-GAN GAN-3'

则下引物为 5'-NTC NTC-3'

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