对性染色体进行关联分析

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早期的研究普遍只做常染色体的全基因组关联分析，很少做性染色体的。

主要原因是性染色体的遗传模式比较复杂，存在X染色体失活，而且男女效应值不大一样。

其次，也不是所有的表型都是男女有差异的。

再然后，也没有很好的工具计算性染色体的关联分析。

随着遗传学的研究发展，现在有很多工具是允许计算性染色体的关联分析。

下面简单介绍一个常见的工具 SNPTEST

SNPTEST支持很多分析

比如，

对于linux系统而言，建议选择动态链接版本（文件写着dynamic）

wget http://www.well.ox.ac.uk/~gav/resources/snptest_v2.5.4-beta3_CentOS6.6_x86_64_dynamic.tgz

tar zxvf snptest_v2.5.4-beta3_CentOS6.6_x86_64_dynamic.tgz

输入文件需要两种类型。一种是表型文件，以 .sample 后缀，一种是基因型文件。

下图是表型文件的格式

第一行是表型的title，第二行是对每一列的数据说明。

注意， 头两行是必须的 ，不然会报错。

先讲第一行的格式：

第一列和第二列是样本的family ID 和个体ID。

第三列是missing，指的是样本的缺失率，这一列可以通过plink的 --missing 参数获得。

第四列到第七列都是协变量。(红色框框)

第八列到第十一列都是表型。(蓝色框框)

最后一列是性别。(绿色框框)

再讲第二行的格式：

第二行的 0 0 0 D D C C P P B B D 又是什么呢

前三个 0 0 0 不需要修改，直接照着写。

红色框框 D D C C 指的是协变量的类型为离散型（D）和连续型（C）

蓝色框框 P P B B 指的是表型的类型为连续型（P）和二分类（B）

绿色框框 D 指的是性别为离散型（D）

基因型文件支持三种格式。

第一种：GEN 或 gzipped GEN 格式，以.gen 或 .gen.gz结尾

第二种：BGEN格式，以.bgen结尾

第三种：plink格式，以.bed结尾

输入如下命令：

./snptest \

-data ./example/cohort1_0X.bed ./example/cohort1.sample ./example/cohort2_0X.bed ./example/cohort2.sample \

-o ./example/ex.out \

-method newml \

-frequentist 1 \

-pheno bin1

解释一下这些参数的意思。

-data 后面跟的是一个或多个队列的基因型文件（.bed）和表型文件（.sample），这里列举了两个队列。在实际的分析中，可以只分析一个，也可以同时分析多个队列。

-o 指的是输出的文件路径（./example/）和文件名（ex.out）。

-method 指的是所用的方法。

-frequentist 指的是用的模型。模型可选加性模型、显性模型、隐性模型、常规模型、杂合子模型。分别用1,2,3,4,5表示。 1=Additive, 2=Dominant, 3=Recessive, 4=General and 5=Heterozygote

-pheno 指的是所分析的表型列名。

报错1：!! Error: (genfile::DuplicateIndividualError) A duplicate sample occurs on line 4 of the file

解决方法：这个报错说明ID_1的字段是一样的。需要将ID_1的每个样本修改为独一无二的字符。可以与ID_2保持一致。

报错2：!! Error: the number of individuals (xxx) in the sample file differs from the number (yyy) in the genotypes file

解决方法：将基因型文件（.bed）的顺序和数量与表型文件（.sample）的顺序和数量保持一致

报错3：二分类表型识别不了

解决方法：将二分类表型修改撑0,1编码，SNPtest识别不了1,2

ATAC-seq信息分析流程主要分为以下几个部分：数据质控、序列比对、峰检测、motif分析、峰注释、富集分析，下面将对各部分内容进行展开讲解。 下机数据经过过滤去除接头含量过高或低质量的reads，得到clean reads用于后续分析。常见的trim软件有Trimmomatic、Skewer、fastp等。fastp是一款比较新的软件，使用时可以用--adapter_sequence/--adapter_sequence_r2参数传入接头序列，也可以不填这两个参数，软件会自动识别接头并进行剪切。如： fastp \ --in1 A1_1.fq.gz \ # read1原始fq文件 --out1 A1_clean_1.fq.gz \ # read1过滤后输出的fq文件 --in2 A1_2.fq.gz  \ # read2原始fq文件 --out2 A1_clean_2.fq.gz \ # read2过滤后输出的fq文件 --cut_tail  \ #从3’端向5’端滑窗，如果窗口内碱基的平均质量值小于设定阈值，则剪切 --cut_tail_window_size=1 \ #窗口大小 --cut_tail_mean_quality=30 \ #cut_tail参数对应的平均质量阈值 --average_qual=30 \ #如果一条read的碱基平均质量值小于该值即会被舍弃 --length_required=20  \ #经过剪切后的reads长度如果小于该值会被舍弃 fastp软件的详细使用方法可参考：https://github.com/OpenGene/fastp。fastp软件对于trim结果会生成网页版的报告，可参考官网示例http://opengene.org/fastp/fastp.html和http://opengene.org/fastp/fastp.json，也可以用FastQC软件对trim前后的数据质量进行评估，FastQC软件会对单端的数据给出结果，如果是PE测序需要分别运行两次来评估read1和read2的数据质量。 如： fastqc A1_1.fq.gz fastqc A1_2.fq.gz FastQC会对reads从碱基质量、接头含量、N含量、高重复序列等多个方面对reads质量进行评估，生成详细的网页版报告，可参考官网示例：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/good_sequence_short_fastqc.html 经过trim得到的reads可以使用BWA、bowtie2等软件进行比对。首先需要确定参考基因组fa文件，对fa文件建立索引。不同的软件有各自建立索引的命令，BWA软件可以参考如下方式建立索引： bwa index genome.fa 建立好索引后即可开始比对，ATAC-seq推荐使用mem算法，输出文件经samtools排序输出bam： bwa mem genome.fa  A1_clean_1.fq.gz A1_clean_2.fq.gz | samtools sort -O bam -T A1 >A1.bam 值得注意的是，在实验过程中质体并不能完全去除，因此会有部分reads比对到质体序列上，需要去除比对到质体上的序列，去除质体序列可以通过samtools提取，具体方法如下：首先将不含质体的染色体名称写到一个chrlist文件中，一条染色体的名称写成一行，然后执行如下命令即可得到去除质体的bam samtools view -b A1.bam $chrlist >A1.del_MT_PT.bam 用于后续分析的reads需要时唯一比对且去重复的，bwa比对结果可以通过MAPQ值来提取唯一比对reads，可以用picard、sambamba等软件去除dup，最终得到唯一比对且去重复的bam文件。 比对后得到的bam文件可以转化为bigWig（bw）格式，通过可视化软件进行展示。deeptools软件可以实现bw格式转化和可视化展示。首先需要在linux环境中安装deeptools软件，可以用以下命令实现bam向bw格式的转换： bamCoverage -b A1.bam -o A1.bw 此外，可以使用deeptools软件展示reads在特定区域的分布，如： computeMatrix reference-point   \ # reference-pioint表示计算一个参照点附近的reads分布，与之相对的是scale-regions，计算一个区域附近的reads分布 --referencePoint TSS   \#以输入的bed文件的起始位置作为参照点 -S  A1.bw \ #可以是一个或多个bw文件 -R  gene.bed \ #基因组位置文件 -b 3000   \ #计算边界为参考点上游3000bp -a 3000   \ #计算边界为参考点下游3000bp，与-b合起来就是绘制参考点上下游3000bp以内的reads分布 -o  A1.matrix.mat.gz \ #输出作图数据名称 #图形绘制 plotHeatmap \ -m  new_A1.matrix.mat.gz \ #上一步生成的作图数据 -out A1.pdf \ # 输出图片名称 绘图结果展示： MACS2能够检测DNA片断的富集区域，是ATAC-seq数据call peak的主流软件。峰检出的原理如下：首先将所有的reads都向3'方向延伸插入片段长度，然后将基因组进行滑窗，计算该窗口的dynamic λ，λ的计算公式为：λlocal = λBG（λBG是指背景区域上的reads数目），然后利用泊松分布模型的公式计算该窗口的显著性P值，最后对每一个窗口的显著性P值进行FDR校正。默认校正后的P值（即qvalue）小于或者等于0.05的区域为peak区域。需要现在linux环境中安装macs2软件，然后执行以下命令： macs2 callpeak \ -t A1.uni.dedup.bam \ #bam文件 -n A1 \ # 输出文件前缀名 --shift -100 \ #extsize的一半乘以-1 --extsize 200 \ #一般是核小体大小 --call-summits #检测峰顶信息 注：以上参数参考文献（Jie Wang，et.al.2018.“ATAC-Seq analysis reveals a widespread decrease of chromatin accessibility in age-related macular degeneration.”Nature Communications） ATAC分析得到的peak是染色质上的开放区域，这些染色质开放区域常常预示着转录因子的结合，因此对peak区域进行motif分析很有意义。常见的motif分析软件有homer和MEME。以homer软件为例，首先在linux环境中安装homer，然后用以下命令进行motif分析： findMotifsGenome.pl \ A1_peaks.bed \ #用于进行motif分析的bed文件 genome.fa  \ #参考基因组fa文件 A1  \ #输出文件前缀 -size  given \ #使用给定的bed区域位置进行分析，如果填-size -100,50则是用给定bed中间位置的上游100bp到下游50bp的区域进行分析 homer分析motif的原理及结果参见：http://homer.ucsd.edu/homer/motif/index.html 根据motif与已知转录因子的富集情况可以绘制气泡图，从而可以看到样本与已知转录因子的富集显著性。 差异peak代表着比较组合染色质开放性有差异的位点，ChIP-seq和ATAC-seq都可以用DiffBind进行差异分析。DiffBind通过可以通过bam文件和peak的bed文件计算出peak区域标准化的readcount，可以选择edgeR、DESeq2等模型进行差异分析。 在科研分析中我们往往需要将peak区域与基因联系起来，也就是通过对peak进行注释找到peak相关基因。常见的peak注释软件有ChIPseeker、homer、PeakAnnotator等。以ChIPseeker为例，需要在R中安装ChIPseeker包和GenomicFeatures包，然后就可以进行分析了。 library(ChIPseeker) library(GenomicFeatures) txdb<- makeTxDbFromGFF(‘gene.gtf’)#生成txdb对象，如果研究物种没有已知的TxDb,可以用GenomicFeatures中的函数生成 peakfile <-readPeakFile(‘A1_peaks.narrowPeak’)#导入需要注释的peak文件 peakAnno <- annotatePeak(peakfile,tssRegion=c(-2000, 2000), TxDb=txdb) # 用peak文件和txdb进行peak注释，这里可以通过tssRegion定义TSS区域的区间 对于peak注释的结果，也可以进行可视化展示，如： p <- plotAnnoPie(peakAnno) 通过注释得到的peak相关基因可以使用goseq、topGO等R包进行GO富集分析，用kobas进行kegg富集分析，也可以使用DAVID在线工具来完成富集分析。可以通过挑选感兴趣的GO term或pathway进一步筛选候选基因。

vcftools --gzvcf input.vcf --chr n --recode – recode-INFO-all --stdout | gzip -c >output.vcf.gz 说明： –gzvcf：处理压缩格式的vcf文件（可替换为–vcf） –chr n：选择染色体n，例：–chr 1 –recode：重新编码为vcf文件,有过滤 *** 作都要加上--recode –recode-INFO-all：将输出的文件保存所有INFO信息 –stdout：标准输出，后接管道命令 –gzip -c：压缩 --max-missing --max-missing的取值是0-1，为1时表示某个位点上所有的样本必须都有基因型，一个样本的基因型都不能缺。所以这个选项可以理解为：能分型的样本占总样本的比例至少为多少。 基本的思想就是利用数据流重定向，把原来输出到屏幕上的数据定向">"到文件里

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