流式细胞仪检测的原理

很简单的啊。

流式细胞仪数据分析

5.1 数据采集及显示

光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。 流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。

根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。 4参数（FSC，SSC，FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。

数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。 图5-1 流式数据分析图

双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。

习题：数据采集及显示

1 在直方图中横轴和纵轴分别表示 。

2 二维点图用于显示参数。

3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表 。

5.2 设门

通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。 图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图

习题：设门

1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。（对 错）

5.3 细胞亚群的数据分析

数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。 如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。

图5-3 选定淋巴细胞亚群设门

门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。 我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。 直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界（见图5-4）。左图中M1为阴性对照峰。右图中M2为CD3 FITC阳性峰。

图5-4 阴性对照峰M1（NORM001）和CD3 FITC阳性峰M2（NORM002） 图5-5的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个。其中M1（阴性）细胞619个，M2（CD3阳性）细胞2272个细胞。淋巴细胞亚群CD3阳性百分含量的统计结果为：M2：2272/2891=78.59%。

图5-5 直方图统计结果

二维点图以双参数显示结果，每个点表示一个或多个细胞。图5-6为阴性对照图，用于设定阴性对照边界，全图划分为四个象限，以区分阴性细胞、单阳性细胞以及双阳性细胞。左下象限（LL）为双阴性细胞，左上象限（UL）为Y轴阳性细胞（CD19 PE），左下象限（LR）为X轴阳性细胞（CD3 FITC），右上象限（UR）为双阳性细胞（CD19+/CD3+）。

图5-6 阴性对照组(NORM001)和CD3 FITC/CD19 PE双染样本(NORM002) 如图5-7所示，淋巴细胞亚群双阳性细胞（CD19+/CD3+）的百分含量为：296/2839=10.43%。

图5-7 散点图统计结果 另一个分析方法是划定区域，也就是设门。我们可以用不同形状的绘图工具定义所选区域（如图5-8所示）；然后统计该区域内指定细胞亚群的百分含量。在图5-9中，R4门内为CD4阳性，CD3阴性的淋巴细胞亚群，其结果为：40/2866=1.40%。

图5-8 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本分析图 图5-9 CD3 FITC/CD4 PE 双染样本数据统计结果

这种方法在分析不同的供体细胞时存在一个缺陷，因为如果事先定义好细胞亚群的区域或边界，在随后的文件中，下一个样本的细胞亚群位置会发生变化，这就需要操作者重新调整区域或边界位置。 为避免这种情况的发生，我们采用一种称为集群分析（cluster analysis）的新方法。BD公司的MultiSETTM 和AttractorsTM软件就属于集群分析软件。该软件的特点是会随着整个细胞亚群的移动而移动，自动变换区域或边界到相应的细胞亚群位置（见图5-10）。

图5-10 使用Attractors分析软件时二维点图的前后变化对比

5.4 流式细胞仪的其它应用以及数据分析

这些分析方法通常适用于计算离散细胞群的百分含量，对于分析单克隆细胞株分子是否呈阳性并不适用。因为单克隆细胞株是单个细胞群，在大多数情况下，既不是100%阴性，也不是100%阳性，所以我们通过几何均值法和中位法统计细胞荧光密度和阳性率。如果样本的统计结果远远大于阴性对照组，那么我们认为其结果是阳性的，两者间的差异越大，说明细胞的表达越高，阳性率越高。 如图5-11所示，左图为单细胞群的散射光信号，右图为阴性对照组和两种不同抗体染色样本的峰叠加图。每个峰的几何均值分别为2，5和20（从左至右）。

图5-11 单细胞株分析图 除检测阳性率，几何均值法和中位法还用于分子（接合子）定量分析。

QuantiCALCTM软件就是使用中值法计算每个细胞的抗体结合位点数。如图5-12所示，Y轴上的圆圈代表从标准曲线获取的信息，用于计算每个细胞的接合点位数。 图5-12 使用QuantiCALC软件计算每个细胞的抗体结合位点数 我们使用ModFit LTTM软件进行DNA定量分析。因为DNA峰（G0/G1期，S期和G2M期）不是离散的，所以我们对曲线以下的面积进行积分，以得到每个细胞亚群的百分含量结果。

图5-13 细胞周期的DNA直方图

习题：数据分析

1二维点图和一维直方图的作用分别是什么？

2 见图5-4和图5-5，CD3阴性和阳性的百分含量分别是多少。

3 LL象限代表双阳性细胞亚群。（对 错）

4 见图5-6和图5-7，淋巴细胞（CD3+/CD19-）的百分含量是多少。

5 只能使用矩形设定细胞区域范围。（对 错）

6 使用区域设定法分析样本有哪些不足。

7 避免细胞亚群移动的分析方法是什么。

8 在定量分析中我们使用哪些分析方法检测阳性率。

5.5 CellQuest和CellQuest Pro软件使用

CellQuest和CellQuest Pro软件是目前运用最为广泛的流式细胞仪采集及分析软件。它运行于苹果电脑上，优质的矢量图显示使得操作界面特别优美。现最新的微软公司的Vista软件也是仿苹果操作系统界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuest Pro时的强大功能及视觉质感。CellQuest和CellQuest Pro软件主安装在BD FACSCalibur型流式细胞仪上。

1．软件数据流程

在CellQuest和CellQuest Pro软件的数据流分为二个部分：方案和数据包。方案是指用户可以建立采集或分析所需的直方图或散点图、设门并定义门与门、门与图之间的逻辑关系。可以使用方案进行数据采集或分析以往已有的数据。每个采集方案分析样本后会生成数据包，该数据包中包括了样本中每个颗粒在各个检测参数上的数值，格式为FCS2.0或FCS3.0。

数据包必须由方案文件打开，无法单独显示，或者可由第三方软件进行分析，如WinMDI。

2.软件与仪器的连接

流式细胞仪需要加电开启后会向计算机发出信息，所以如要进行实验需要先开启流式细胞仪，然后再开启计算机。

1、 先开仪器后开计算机，以确保仪器和计算机之间的正常通讯。

2、 在苹果菜单下点击CellQuest和CellQuest Pro软件。

3、 从Aquire菜单下选择connet to cytometer。

3．方案与数据之间的关系

CellQuest和CellQuest Pro软件的方案与数据相互独立保存，数据包可以由任一方案文件进行分析，分析后不改变数据包中的任何数据。CellQuest和CellQuest Pro软件中方案内的直方图或散点图有三种状态：Acquire，Analysis和Acquire-Analysis。

当图的属性为Acquire时，此图只限于采集下用，即只当进行检测时它才能显示颗粒；

当图的属性为Analysis时，此图只限于分析已保存的数据包，它不能用于采集数据。

当图的属性为Acquire-Analysis时，此图即可用于采集数据也可用于分析已有数据。

所以方便起见，我们一般将方案中的直方图或散点图全部设为Acquire-Analysis属性。

CellQuest Pro CellQuest

4．方案的建立

A选择实验参数

默认情况下，FACSCalibur流式细胞仪开机后只打开一根激光器，及五个参数供选择使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3。当我们要使用第二根激光器及FL4通道时需要勾选FL4的选项，仪器自动打开633nm激光器。

B,建立散点图或直方图，命名坐标

CellQuest Pro软件主要工作界面，软件类似于Office word的工作面，可在A4大小的页面上进行编辑建立各种直方图或散点图。

在CellQuest软件下，需在选择Plot菜单，选择Format来打开图的属性对话框，其中包括了关于该图所有选项。

建立好直方图或散点图后，我们需要对所选的参数进行命名，如不修改软件自动命名为FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4。

在菜单上选择Acquire栏目，选择Parameter Description，可出现关于文件存储和参数命名的对话框。在这个对话框中用P字母来代表每个参数，并在此对每个采集参数进行命名，FL1为CD3FITC，FL2为CD4PE……。

C,设门并建立门与图之间的关系

R与G的关系

R是Region的首个字母，Region一般是指一个闭合形的区域，如矩形区、自由区和圆形区。区域与区域之间可以进行逻辑运算，如AND、OR、NOT等关系。当区域进行运算时软件引进了算术公式的管理概念：

Gate实际了个代数式，简称G，其运算式默认如下：

G1 = R1，或G2=R2

当我们要进行逻辑运算时，可变更为G1=R1 AND R2。此时G1就成了一个算术结果了。

G1=R1 AND R2

G2=R1 NOT R2

G3=R1 OR R2

Region List管理门，可以重命名或删除门。Gate List是对门进行逻辑运算和标识颜色的工具。

建立门与图之间的关系

打开要编辑的直方图或散点图的属性对话框，选择Gate选项，选择门即可。

D，显示统计参数

5．仪器的操作

当计算机与流式细胞仪联机后便会出现以下采集控制框：

在有关仪器操作所有控制选项框都在Cytometer下拉菜单下，同时按住“苹果”键及1、2、3、4便可调取所有控制框：

6．文件的保存及调用

实验或分析过程中所建的方案可以保存下来，通File下拉菜单可以保存这些方案文件：

如要打开这些分析方案只需双建方案图标即可；方案可以分析以往的数据包（前提是方案中的直方图或散点图都已定义成Acquire-Analysis属性），有两种方案打开以往的数据：

方法一：选择直方图或散点图，打开该图的属性框（Plot->>Format），见下图：

在以上红色框标注的地方选择要分析的数据包。

方法二：选中方案中所有的直方图或散点图，打开Plots菜单，选择Chang Data File，打开要分析的数据包。

附：CellQuest Pro软件所有下接菜单

前脂肪细胞系有3T3一Ll、3T3一F442A、ob17等系列，是由近足月的鼠胚胎中分离出的瑞士3T3细胞克隆得到的。

前脂肪细胞株3T3-L1具有定向分化为成熟脂肪细胞的特性，能充分显示在体细胞的特点，包括形态学改变、多种脂肪代谢酶的表达、广泛的脂质积聚等，是体外研究脂肪细胞的理想实验细胞模型。

激发波段在488的荧光染料有哪些

碘化丙啶(propiolium iodide,PI)能嵌入DNA双螺旋中,可使荧光强度增加约20倍,以488nm波长激发,DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm.

1.小鼠Lewis肺癌细胞DNA含量测定方法

(1).从C57BL/6小鼠上切除肿块,在培养皿内用PBS冲洗.

(2).去除结缔组织及脂肪,剪碎肿块.

(3).小碎片移入1.20×38mm注射针,加压使其通过,于4℃条件下重悬细胞于HBSS中.

(4).将200～300μL细胞悬液(5×105细胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL),染色3LL细胞,于4℃存放20～30分钟.

(5).测定580～750nm之间的发射荧光,以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分.

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