实验室小白篇：细胞培养用的液体

一、细胞培养所需的培养液

在细胞的研究和利用过程中，最主要的是要为细胞提供最适的生长条件，保持细胞培养开始时的群体状态。这就要求培养条件始终如一，近乎呆板地坚守细节和常规，而且细胞培养，试剂昂贵，费时、费力，不是随随便便就可以进行的。

细胞只有在最适生长条件下，才会保持正常的核型及功能。如果培养条件上打折扣，就意味着会出现带有染色体重排或突变变异株细胞。某些营养成分或生长因子用量不足或细胞高密度培养时间过长，都不是最适生长条件。

二、平衡盐溶液

平衡盐溶液具有维持渗透压、调节酸碱平衡的作用，同时可以供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。最常用于洗涤组织或细胞、配制培养用液的基础溶液是Hanks 溶液和磷酸缓冲盐溶液（简称PBS) 。

三、血清

血清中含有丰富的营养成分，包括多种生长因子及许多未知成分。动物细胞的生长都依赖血清。血清的种类很多，包括胎牛血清、小牛血清、马血清、兔血清、人血清等。

选择一批最适于细胞的血清是很重要的，而且如有可能的话，应要求购买来源公司保留足量，以供应实验使用。这样可避免反复试用以选择最适血清所产生的费用。血清的质量可以通过检测细胞的克隆形成率来衡量。取对数生长期的细胞彻底消化后，以低密度（直径6mm 的平皿中加入约103个细胞）接种5~6 个平皿， 其中一个平皿中加入含30％血清的培养液，以测定高浓度血清的细胞毒作用。7~ 10d 后，出现肉眼可见的克隆时，倒掉培养液， 2％亚甲蓝染色2~5min,观察克隆形态、计算克隆形成率。克隆形成率一般为5%~ 10%。

四、抗生素

一般细胞培养时，抗生素不是必需添加成分。但一些特殊情况下培养液内需加入适量的抗生素，如怀疑有污染、原代培养时、新手操作不够熟练。常用的抗生素有青霉素、链霉素、卡那霉素和庆大霉素。青霉素常用剂量为100U/ml ,链霉素常用剂量为100μg/ml。常配制成100 倍或200 倍， 分装为小包装， 于－20℃条件下保存。一次用一个小包装， 避免反复冻融 。

五、特殊的添加因子

特殊的添加因子可以使细胞培养的条件得到优化。原代培养细胞接种密度需适当提高，应尽可能用营养丰富的培养液，如使用胎牛血清。这些都属于一般优化条件。细胞培养条件优化的原则是：根据细胞类型， 模拟体内环境， 添加不同的细胞生长因子及有利于细胞生存、增殖的添加剂。表1 是常用的细胞培养添加成分。

表 1 常用的细胞培养添加成分

一种细胞生长因子常常是多种细胞的丝裂原，如碱性FGF, 不仅是成纤维细胞的丝裂原，还是内皮细胞、角质细胞、黑素瘤细胞的丝裂原。EGF 可促进上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞及平滑肌细胞等多种细胞的增殖。

培养干细胞时，常添加白血病抑制因子( leukemia inhibitory factor, LIF ) ，又称分化抑制因子( DIA )， 是一种分泌型多肽，可抑制小鼠干细胞的自然分化。一般，可用纯化的LIF 直接加到培养液中，或使用用LIF表达载体转染过的饲养层细胞。正常的STO 细胞也可分泌。STO 细胞还分泌其他一些促干细胞生长的因子。目前，多数实验室仍使用饲养层细胞。重组的LIF 来源方便，与STO 细胞一起使用时，常用浓度为1000U/ml 。与小鼠胚胎成纤维细胞一起使用时，常用浓度为500U/ml 。

体外培养正常细胞需要使用不同生长因子的选择性组合。通常在已有的经典培养液配方基础上，添加不同因子而成。现在已有多种特定细胞培养液，且有商品供应，如血管内皮细胞培养液、神经干细胞培养液、骨髓干细胞培养液、间充质干细胞培养液、小鼠心肌细胞培养液(Claycomo Medium) 等。

六、消化液

细胞生长至一定密度时，需进行传代。消化液可使细胞脱离生长表面，离散成单个细胞。常用的消化液是0.25%、0.125％的胰蛋白酶和0.02％的二乙胺四乙酸二钠(EDTA) 溶液，以无钙镁的PBS 或Hanks溶液配制。它们可单独使用，也可按一定比例混合后使用。大部分细胞的消化可使用终浓度为0.05%胰蛋白／0.02%EDTA混合液。有些上皮细胞贴壁力强，需较高浓度的胰蛋白酶(0.25%）或延长消化时间，甚至需要37°C温育。如果温育较长时间（超过20min)细胞仍不能脱壁，则应采取分步消化的措施，即将已脱壁细胞移出至离心管，加完全培养液中和胰蛋白酶的作用，对未脱壁的细胞再添加新胰蛋白酶再次消化。

七、细胞培养用的其他液体

细胞培养时，还会用到其他一些液体，如谷氨酰胺、HEPES 、丙酮酸钠、各种细胞生长因子、各种组织或细胞条件培养液，以及调整pH 使用的5.6%NaHCO3等。

谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，会导致细胞因生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故要适时添加。可配制200倍液体－20℃ 冰箱中保存，在使用前加入培养液内，终浓度为2mmoVL 。

HEPES 是一种非离子缓冲液，在pH 7.2~7.4 范围内具有较好的缓冲能力，在高浓度时对一些细胞可能有毒。HEPES缓冲液可与低水平的碳酸钠( 0.34g/L)共用，以抵消因额外加入HEPES引起的渗透压增加。安全浓度范围10~25mmol/L。丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。一些生长缓慢的细胞加入，可明显改善细胞状态。通常配制200倍液，-20℃ 冰箱保存，在使用前加入培养液内终浓度为1mmol/L。

另外， 2－巯基乙醇(2-Mercaptoethanol, 2-Me) 对细胞生长有很重要的作用。有人认为它相当于胎牛血清， 有直接刺激细胞增殖作用。2-Me 的活性部分是硫氢基，其中一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖，为非特异性的激活作用。同时避免过氧化物对培养细胞的损害。另一个重要作用是促进分裂原的反应和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA) 对淋巴细胞的转化作用，已广泛应用于杂交瘤技术。也开始用于一些难以培养的细胞。常用终浓度为5×10-5mol/L。常配制成0.1mol/L 的储存液，用时每升培养液加0.5ml 。

如果是化时间不长赶紧放回冰箱中，应该问题不大。一般溶解后放置于保存于2～8℃的冰箱冷藏可以至少保存一个月。

一、单克隆抗体的保存

由腹水中获得的抗体,经离心去除细胞成分，再经冷冻超速离心,取上清液加0.1%NaN3，少量分装，冷冻于-70℃可保存几年。 但应避免反复冻融,否则抗体失活，特别是IgM抗体。提纯的单克隆抗体,冷冻干燥保存于2～8℃，取出时溶解后，保存于2～8℃，至少一个月内可保持稳定。腹水抗体也可冷冻干燥低温(4℃)保存两年，融化后放置4℃下保存一个月。短期使用的腹水抗体，4℃3～4 个月仍保持稳定, 培养上清加0.1%NaN3，贮于-20℃，两年不失活性。

二、NaN3简介

叠氮化钠亦称“三氮化钠”，化学式NaN3，分子量65.01，白色六方系晶体，无味，无臭，纯品无吸湿性。剧毒。相对密度1.846。

不溶于乙醚，微溶于乙醇(25℃ 时0.3)，溶于液氨(0℃时50.7)和水(0℃时 39、10℃时40.16、100℃时55)。虽然无可燃性，但有爆炸性。

较其他叠氮化物稳定，在真空中加热不爆炸，可逐渐分解为金属钠及氮气，是高纯度金属钠的实验室制造方法之一[1] ，也是高纯度N2实验室制造方法之一。与酸反应产生氢叠氮酸(HN3)，反应化学式如下：2NaN3+H2SO4→Na2SO4+2HN3，氢叠氮酸为低沸点(37℃)无色液体。

用途：

1. 叠氮化钠为照相乳剂的一种防腐剂。可加入乳剂中，或加到中间层及保护层中，不影响乳剂照相性能，具有优良的防腐杀菌性能。配制叠氮化钠血液培养基。分析化学上用于分析硫化物及硫氰酸盐的试剂。有机合成。制造氢叠氮酸、叠氮铅、除草剂。用于汽车的安全气囊中，当发生车祸时迅速分解放出氮气，使安全气囊充气。

2. 用作医药原料，由叠氮化钠制备四唑类化合物，进一步合成抗生素头孢菌素药物，而四唑类化合物还是彩色摄影用药剂。

3. 用作耐热性特殊雷管的起爆剂叠氮化铅的原料。合成树脂发泡剂。用作吸收及除去真空管内残余气体。用作有机合成原料、农药原料、分析试剂。

4. 用作药品和炸药，也用来制叠氮酸、叠氮酸酯、叠氮化铅和纯的金属钠。

5. 用作有机合成原料、农药原料、分析试剂。用作药品和炸药，也用来制叠氮酸、叠氮酸酯、叠氮化铅和纯的金属钠。

6.从20世纪90年代开始叠氮化钠用作汽车司机安全防护袋的气源，紧急刹车时，立即自动充气

犬瘟热治疗方案：

1、大剂量抗病毒：我是用的利巴韦林，也可以是用病毒唑，不过我偏爱前者，皮下注射（注意应注射狗狗颈部皮肤），一次一支（2ml），一天两次，不要稀释。

2、大剂量抗炎：我选择的是头孢三代的头孢噻肟钠，当然还可以选择其他，考虑经济因素，这个比较便宜，皮下注射，用灭菌注射水4ml溶解1g粉针，一次注射一半，一天两次。

3、增强免疫力：条件好的可以选择血清、免疫球蛋白、单抗、胸腺肽。考虑经济原因，我选择了口服的贞芪扶正胶囊（也可以是贞芪扶正颗粒），贞芪扶正是由黄芪、女贞子组成，多帮助癌症及虚弱患者增强抵抗力，疗效不错。如用胶囊，一次两颗，一天两次，取出胶囊内容物用温水稀释；如用颗粒，一包分成两次吃，温水稀释。（狗狗一般不吃，需要灌入，但注意避免引起呛咳）。

4、止咳平喘：依然选择中药，但不宜多，推荐是用川贝枇吧止咳露，一天三次，适当即可。

5、顺气止吐：藿香正气液（不要用藿香正气水，太苦，刺激狗狗胃肠），少量即可，一天两次，不吐后停用改用清开灵口服液一天两次，一次一支。

6、其他对症处理：无食欲，稀饭（混合青菜、肉末，最好不此时放猪肝，宜清稀，灌入狗狗嘴中。如果无法进食或者食即吐，就只有输液（肌苷＋10%葡萄糖＋维C），但是关键看你有没有输液水平了

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