病原微生物中细菌常见检测方法有哪些_备孕

病原微生物中细菌常见检测方法有哪些

病原微生物种类繁多，变异迅速，快速鉴定病原微生物的检验技术也在不断发展前进著。目前，应用比较广泛的病原微生物检测方法主要有直接涂片镜检、分离培养、生化反应、血清学反应、核酸分子杂交、基因晶片、多聚酶链反应等，该文对这些检测技术进展做一综述。对人和动物具有致病性的微生物称为病原微生物，又称病原体，有病毒、细菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体、真菌、放线菌、朊粒等。这些病原微生物可引起感染、过敏、肿瘤、痴呆等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年来出现的SARS、高致病性禽流感、西尼罗病毒感染等疾病的传染性极强，往往造成世界性大流行，因此对病原体的检测必须做到快速、准确。常规病原学检测方法操作繁琐，检测周期长，而且对操作人员技术水平要求比较高。随着医学微生物学研究技术的不断发展，病原学诊断已不再局限于病原体水平，深入到分子水平、基因水平的检测手段不断出现并被应用于临床和实验室 J。核酸分子杂交技术、PCR技术、基因晶片技术等检测方法，自动化程度高，快速省时、无污染、结果精确，可以准确灵敏地鉴定病原微生物。1 传统的病原微生物的检测方法传统的病原微生物学实验室检查以染色、培养、生化鉴定等为主，将标本直接涂片染色镜检和接种在培养基上进行分离培养是对细菌或真菌感染性疾病进行病原学诊断的常用方法。1．1 直接涂片镜检病原微生物体形体积微小，大多无色半透明状，将其染色后可借助显微镜观察其大小、形态、排列等。直接涂片染色镜检简便快速，对那些具有特殊形态的病原微生物感染仍然适用，例如淋球菌感染、结核分枝杆菌、螺旋体感染等的早期初步诊断。直接涂片镜检不需要特殊的仪器和装置，在基层实验室里仍然是十分重要的病原微生物检测手段。1．2 分离培养与生化反应分离培养主要用于临床标本(如血液、痰、粪便等)或培养物中有多种细菌时对某一种细菌的分离。细菌的生长繁殖需要一定时间，检测周期较长，不能同时处理批量样本。为解决这一问题，各种自动化培养和鉴定系统不断产生，传统鉴定方法也在逐步改进，大大加快了检验速度。例如Microscan WalLCAway全自动微生物分析仪，可同时做细菌鉴定和药敏试验，检验500多个菌种。苛养菌如肺炎链球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌等对营养要求比较高，常规培养阳性率低。雍刚等将不要同比例的葡萄糖、玉米淀粉、生长因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌剂加入到巧克力培养基中制成了新型淋病奈瑟菌培养基，大大提高了淋病奈瑟菌的分离培养率。苏盛通等在营养琼脂中加人了中药红枣、赤小豆培养甲型链球菌、乙型链球菌、肺炎链球菌等细菌，生长指数明显高于血平板。1．3 组织细胞培养活组织细胞培养适于专营活组织细胞内生存的病原体，包括病毒、立克次体、衣原体等。不同病原体敏感的组织细胞是不一样的，将活细胞从病原体敏感的动物组织中取出在体外进行原代培养或用病原体敏感细胞系进行传代培养，再将病原体接种于相应的组织细胞中后，病原体可在其中繁殖增长，引起特异性的细胞病变效应。也可以将病原体直接接种于敏感动物体内，引起相应组织器官出现特异的病理学改变。往往可以根据这些特异的病变对病原体进行鉴定。2 血清学与免疫学检测血清学检测是通过已知的抗体或抗原来检测病原体的抗原或抗体从而对病原体进行快速鉴定的技术，简化了鉴定步骤，常用的方法包括血清凝集技术、乳胶凝集实验、荧光抗体检测技术、协同凝集试验、酶联免疫测试技术等。酶联免疫技术的应用大大提高了血清学检测的敏感性和特异性，不仅可检测样本中病原体抗原，也可检测机体的抗体成分。幽门螺奸菌在我国人群感染率高达50％～80％，应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测唾液中抗HP抗体来诊断HP感染，其结果满意。乙型肝炎病毒(HBV)在我国人群中感染率极高，ELISA应用於乙型肝炎病人早期血清学诊断的效果最为明显。临床上致病菌往往和非致病菌混合在一起，如何从这些细菌中分离出目标菌是关键。免疫磁珠分离技术(IMBS)是近年来发展起来的在微生物检测领域中一种新技术。其基本原理是将特定病原体的单抗或多抗或二抗偶联到磁珠微球上，通过抗原抗体反应形成磁珠一目标病原体复合物或磁珠一一抗一目标病原体复合物，在外部磁场磁力的作用下，将目标病原体分离出来。目前已经开发出了针对各种病原体的免疫磁珠，如大肠埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、军团菌等，广泛应用到各级科研和实验室。经IMBS分离出的白色念珠菌可直接在显微镜下检测，检测时间缩短至4 h。IM—Bs还可以和其它检测技术联合来检测病原菌，免疫磁珠分离得到的目标菌可继续用于分离培养使大肠埃希菌0157最低检测限由200 cfu·g 提高到2 cfu·g～；IMBS结合聚合酶链反应(IMBS—PCR)可对培养条件比较特殊的细菌如苛养菌、厌氧菌进行快速检测，肉类中的产毒素型产气荚膜梭菌经IMBS．PCR检测

微生物的快速检测方法有哪些

目前主要普通培养（简称标）般报告要用仪器、核酸检测（PCR）、目前快速检测（主要包括：免疫磁珠、酶联免疫试剂盒、金标检测卡等根据自需求选择

食品微生物的检测方法有哪些？

目前主要有普通培养法（简称国标方法）一般出报告的要用，仪器法、核酸检测法（PCR）、还有目前的快速检测法（主要包括：免疫磁珠、酶联免疫试剂盒、金标检测卡等。这个根据自己的需求来选择吧。

简述hiv的微生物学检测方法有哪些

梅毒是由苍白螺旋体感染引起的一种性传播性疾病。梅毒螺旋体感染人体后出现两种抗体：一种是特异性抗体(TPHA)，为lgM。当有补体存在和厌氧条件下，对活螺旋体的动力有抑制作用，并可将螺旋体杀死或溶解，对机体的再感染有保护作用。另一类是非特异性抗体（快速血浆反应素 RPR）。为lgA与lgM的混合物，可与正常生物组织中的类脂抗原发生非特异性结合，对人体无保护作用

微生物的传统检测方法有哪些？

传统检测有三种方法

1、直接显微镜观察，正常情况，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度以及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。可以通过显微镜观察菌落特征对微生物种类进行判断。

2、选择培养基培养微生物或人为提供有利于目的菌株生长的条件，选择培养基，其作用是允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养一般是通过观察微生物的同化作用型别或某一特征进行间接判断，得到的微生物往往并不只有一种，但是能够大致确定这些微生物存在的共有特征从而对其分类。

3、鉴别培养基，根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品。与选择培养相比，鉴别培养基的鉴别所得结果的范围比较小，一般可直接测定某微生物的种类。

现代定义

微生物：个体难以用肉眼观察的一切微小生物之统称。

微生物包括细菌、病毒、真菌、和少数藻类等。（但有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”，但是它的生存必须依赖于活细胞。

根据存在的不同环境分为空间微生物、海洋微生物等，按照细胞机构分类分为原核微生物和真核微生物。

主要特征

1、体小面大

2、吸多转快

3、生长繁殖快

微生物的这一特性使其在工业上有广泛的应用，如发酵、单细胞蛋白等。微生物是人类不可或缺的好朋友。

水产品致病微生物检测方法有哪些

这个是我在网上找到的的微生物的检测试纸片，也不知道方法咋样，你要也可以去网站上看看的

像大肠杆菌测试纸片肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种新出现的食物传播性疾病的病因。它除了引起腹泻、出血性肠炎外，还可发生溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等严重的并发症。自1982年美国首次发现因该致病菌引起的食物中毒以来，肠出血性大肠杆菌O157:H7疫情开始逐渐扩散和蔓延，相继在英国、加拿大、日本等多个国家引起腹泻爆发和流行。我国已陆续有十余个省份在市售食品、进口食品、腹泻病患者、家畜家禽等分离到大肠杆菌O157:H7。大肠杆菌O157测试片（FilmplateTM E.coli O157BO204）3方元方圆生物的采用进口高选择性显色培养基作为主要原料，运用专有技术，做成一次性快速检验产品，一步培养15～24h就可确认，大大地简化了检测程式，非常适合各级检验部门和食品企业使用。本品适用于海产品、水产品、各类熟肉制品和冷荤、蛋及蛋制品等的快速检测。参照标准：食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验（GB/T4789.36）。

物体表面的微生物检测方法有哪些

用浸有灭菌生理盐水的棉签在被检物体表面取25cm2 的面积，在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的取样管内送检。擦拭时棉签要随时转动，保证擦拭的准确性。对每个擦拭点应详细记录所在分场的具 *** 置、擦拭时间及所擦拭环节的消毒时间

牛奶中细菌检测方法有哪些

先配制固体培养基，再划线培养1天，之后挑每一种菌落的细菌制片，显微镜下观察细菌的种类

10种常用的细菌检测方法

一、[3H]脱氧胸苷摄入法测定细胞数：

1、用RPMI-1640培养液洗涤对数生长期（培养3天）的CTLL-2细胞两次，每次250×g离心10分钟，洗去培养液中残存的IL-2。

2、用台盼蓝（1% Trypan blue）染色法计数细胞并决定细胞的活力，用10%小牛血清的RPMI-1640培养液悬浮细胞至1×105/ml。

3、在96孔细胞培养板中每孔加0.1ml倍比稀释的标准IL-2或待测样品，每个稀释度三个复孔，标准IL-2从40 IU/ml稀释到0.019 IU/ml（8～10个稀释度），阴性对照孔不加IL-2。

4、每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养18～24小时。每孔加10μl（0.5μCi或1.85×104Bq）[3H]脱氧胸苷，继续培养4小时。

5、用多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用3%醋酸水溶液滤纸3次，洗去游离的[3H]TdR。将滤纸置液体闪烁瓶中，加入5ml闪烁液。在液体闪烁仪上计数细胞摄入的同位素活性（每分钟放射性计数，cpm），根据仪器效率换算成dpm（每分钟衰变数）。

6、用dpm值对样品稀释倍数作图。在图上，标准IL-2的曲线与待测样品的曲线应当呈平行的S型，说明是同样的分子反应。比较同样dpm处的不同稀释倍数，决定待测样品的相应浓度。

二、MTT检测法：

1、取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×104～10×104靶细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）

2、用RPMI-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个：3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时或预定的时间。

3、吸去培养液，用PBS洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板）。

4、每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～6小时。

5、每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10% SDS的10mmol/L HCl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长570nm，参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。

三、XTT检测法：

用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤，XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物（formazan）。代谢产物在OD450处有吸收峰。

四、MTS检测法：

1、培养IL-2依赖细胞株CTLL-2细胞或HT-2细胞（检测IL-2），或者IL-3依赖细胞株FDC-P1细胞或FL5.12细胞（检测IL-3）到对数生长期。

2、取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml含1×104～2×104上述细胞之一的DMEM培养液（加10%小牛血清）。

3、每孔加0.1ml系列稀释的待测细胞因子（IL-2或IL-3）样品或细胞因子标准品，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24小时。

4、每孔加20μl MTS/PMS混合液，继续培养3～4小时显色。

5、检测前摇晃培养板10秒钟，混匀颜色。在酶联检测仪上，波长570nm（或490nm，或570nm和690nm）处检测各孔的光吸收值（OD）。用样品稀释度对OD值（OD570、OD490或OD570/OD690）绘制剂量-反应曲线，根据标准品曲线计算样品中细胞因子的量。

五、NAG检测法：

1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。

2、吸去培养液，用PBS洗涤两次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前先离心）。

3、每孔加60μl NAG染液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。

4、每孔加90μl终止液，混匀后置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长402nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。

六、AlamarBlueTM摄入法：

1、按MTT检测法培养细胞和用不同稀释度的细胞因子处理细胞。

2、在培养结束前24小时加入Alamar Blue染料，96孔细胞培养板每孔20μl。

3、在培养结束后，直接在酶联检测仪上测定光吸收值。氧化型Alamar Blue的最大光吸收在570nm，用OD570减去OD600即为活细胞还原的Alamar Blue染料，颜色深浅与活细胞数成正比。

七、碱性磷酸酶检测法（AKP法）：

1、按MTT法用细胞因子处理靶细胞适当时间，用PBS洗去死亡细胞，洗两次。

2、向96孔细胞培养板各孔中加0.2ml新鲜配制的底物液（0.2mol/L 硼酸，1mmol/L MgCl2，1.2mmol/L甲伞基磷酸）。在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养3小时。

3、在荧光计数仪上测定荧光的量。根据测定已知不同数目细胞的荧光量作出标准曲线，根据标准曲线可得到各孔中的活细胞数。

八、三磷酸腺苷检测法（ATP法）：

1、ATP反应液（Bio-Orbit）是粉末状混合物，含有荧光素、荧光素酶、0.5mmol醋酸镁、50mg BSA和0.1μmol无机焦磷酸。在4℃可以保存1个月。用前用10ml含2mmol/L EDTA的0.1mol/L pH7.75 Tris-醋酸缓冲液稀释。稀释液分装后可在－20℃长期保存。

2、在已经完成促增殖或抑生长试验后的96孔细胞培养板中（每孔含100μL细胞培养液），每孔加0.1ml ATP释放因子，室温中反应5分钟。取另一块96孔细胞培养板，从第一块板的各孔中吸0.1ml细胞溶解物到第二块板的相应各孔。

3、在低于25℃中，将第二块板置自动多孔荧光检测仪中。用自动加样器，每孔加入20μl ATP反应液，立即检测10秒钟的荧光强度。温度升高，检测敏感性就下降。

4、用RLU（Y轴）对细胞因子标准品的稀释度（X轴）作标准曲线，根据标准曲线确定待测样品中细胞因子的含量。

九、染料染色法测定细胞数：

1）结晶紫检测法：

1、在96孔细胞培养板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164细胞的培养液（含10%小牛血清的RPMI-1640培养液），37℃ 5% CO2的二氧化碳培养箱中培养2～3小时，让细胞帖壁。

2、用RPMI-1640培养液10倍递次稀释TNF标准品，根据需要3～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品或待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个，3个阳性对照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔各加100μl RPMI-1640培养液。继续培养18～24小时。

3、甩去培养液，用PBS小心洗涤一次，每孔加0.1ml 10%甲醇溶液固定细胞30秒钟。

4、吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml结晶紫染液，室温中放置20分钟。

5、轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室温中长期保存。

6、测定前，每孔加0.1ml 33%醋酸脱色，充分振荡后在570nm处测定光吸收度。用光吸收度（OD）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性

2）NBB检测法：

1、在用细胞因子处理靶细胞以后倾去培养液，倒置培养板于吸水纸上吸干培养液。再用100μl磷酸缓冲盐水小心洗去死细胞，用吸水纸吸干培养液。

2、每孔加100μl NBB染液，室温中染色30分钟。轻轻染液。用吸水纸吸干染液。</P<p>

3、每孔加100μl福尔马林固定液固定15分钟。用自来水轻轻洗去固定液，倒置培养板，用吸水纸吸干染液。

4、每孔加150μl 50mmol/L氢氧化钠。轻轻振荡培养板直到染料全部溶解并均匀分布。在分光光度计上读取各孔在620nm处的光密度（OD）值。计算TNF的活性。

3）美蓝染色检测法：

1、用细胞因子处理靶细胞，在含100μL细胞培养液的检测孔中，每孔加0.02ml 25%戊二醛固定活细胞15分钟，用自来水缓缓洗去死细胞和固定液。

2、每孔加0.1ml 0.05%美蓝染液，染色20分钟，用自来水缓缓冲净染液，晾干。