做ELISA的关键步骤是什么?

做ELISA的关键步骤是什么?,第1张

ELISA关键是订一个可靠的试剂盒。

如果盒子已经订了,剩下的就是自己操作了。

一个,尽量用八道或者十二道移液器加样。对于相同的试剂,经如二抗,酶,显色液,终止液等。

另一个,自己的样品,因为每一孔的样品不一样,用排枪加有些麻烦,如果一次的样品比较少,而自己加样又比较快,可以一个孔一个孔的加,但如果想一次把96或者48T的做完,可以先摆好一些PCR管或者准备一个96孔细胞培养板。将自己的样品先加到PCR管或者培养板中(此板间距与酶板板相同)。记得加一定的余量,如一次加样是50ul,可以先加70ul。加完后再用排枪加样,这样可以缩短加样时间,减小每个孔间的时间误差。

另一个,如果有多余的孔,标准品孔可以做复孔,在自己的样品前加一次标准品,加完样品后再加一次标准品。

如果孔不够,那么可以将标准品放在样品中间加(比如先加四十个孔,加完标准品再加五十孔)

1、用OVA(卵清蛋白)做一些哮喘,过敏性肠炎的模型,后来会检测粘膜特异性的sIgA以及血清里面IgG,IgE等指标。

2、对于一些小分子的检测,比如前列腺素、糖皮质激素的检测,我的理解是要用竞争法ELISA去检测,也要采用这个方法的盒子。一般细胞因子的检测,都是采用常规的夹心法ELISA检测,因为因子分子量比较大,一般10几个KD左右,很容易找到两个或者多个抗原表位。而小分子很难找到两个不同的表位,也就决定了包被抗体和检测抗体无法同时结合小分子并固相化。解决方案就是酶标板上包被二抗,每个孔加入一定量的酶标的小分子,然后加样品,再加不带标记的检测抗体,显色底物。样品的目的小分子的含量越高,吸光度越低。

3、对于胰岛素的检测。

4、做实验面向的ELISA试剂盒种属主要是人,大鼠和小鼠,现在市面上鸡、牛、马、羊、兔各种指标的盒子都有售,真不知道这些抗体是怎么来的。这些炎症指标还是有很大种属特异性的。

5、好多人有个误区,拿来一个指标就想当然地尝试用ELISA去检测,其实应该多动脑,该检测活性的检测活性,该做western的做western。ELISA试剂盒检测方法简单,灵敏度高。


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