抗原抗体反应的应用

（1）抗原：免疫动物是制备抗血清的第—步。免疫所用的抗原可用病毒、细菌或者其他蛋白质抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必须与大分子载体连接。抗原的用量视抗原种类及动物而异，—次注射小鼠可以少至几个微克，免、羊甚至更大的动物每次注射的量就相应增加，从几百μg/次至几mg/次。

〔2）佐剂及乳化：佐剂可以帮助抗原在注射部位缓慢释放，以增加免疫刺激的效果。佐剂有完全和不完全佐剂之分。完全佐剂加有灭活的分枝杆菌（如卡介苗）或棒状杆菌。福氏佐剂可从试剂公司购买，也可用羊毛脂和石蜡油按1：2—4混合自行制备。佐剂与抗原按1：1的比例混合乳化为均匀的乳液，放置后不会发生油水分离。

（3）免疫动物：常用于制备抗血清的动物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生产可用动物羊、马等，动物接受免疫的乳液量小鼠为1．0—2．0 mL，家兔为2—4mL。抗原免疫动物的途径取决于动物种类、抗原特性和是否使用佐剂。腹腔注射（i．p），肌肉注射（i．m），皮内注射（i．d．）和皮下注射(s．c．）适合于任何抗原，这些途径主要刺激局部淋巴结发生免疫应答，初次免疫和免疫加强注射均可使用。静脉注射（i.v.）则只适合于可溶性抗原及分散的单细胞悬液，且不能使用佐剂，其诱发的免疫应答主要发生在脾脏。此外，在单克隆抗体制备时，亦可用脾脏直接注射或体外免疫方法，尤其对微量抗原比较实用。体外免疫方法也常用于人源单克隆抗体的制备。体外免疫时将脾细胞或外周血淋巴细胞（包括B细胞，T细胞及抗原递呈细胞）与抗原一起作体外培养，然后再与骨髓瘤细胞融合。初次免疫后要经过2—3次以上的免疫加强以保证能形成较高水平的IgC抗体。两次免疫注射之间的时间间隔，一般3—4周比较适合大部分动物，小动物可间隔10—14d，大动物则在2月左右。在免疫加强最后一次注射后的一周内采集抗血清，可获得高水平的抗体。 （1）采血：加强免疫的动物2—3次后，可通过耳静脉或眼球（小鼠）采血，进行抗血清效价测定。当效价达到理想的高度后，可以采血。采血方式可以从心脏直接取血，也可通过动脉放血。待血液凝固后用针筒或吸管吸取血清。

（2）抗血清的纯化与保存：除抗体外血清中含有多种其他蛋白成分。为了避免这些蛋白质干扰抗体（免疫球蛋白）标记反应和抗原抗体反应，抗血清可经过纯化以获得单一的机体（常为IgG）组分。常用的纯化IgG的方法为饱和硫酸胺盐析和层析法。蛋白质在不同的盐浓度的溶液中，其溶解度不一样，盐离子干扰蛋白质和水分子间氢键形成，因为水—盐结合比水—蛋白质结合更稳定，蛋白质即可从溶液中沉淀出来。蛋白质分子越大，沉淀时所需盐离子浓度越低。免疫球蛋白（Mr 1.5×105）比血清中主要蛋白质白蛋白（M r 6.7×104）的分子大得多，抗体在30%—50%饱和度的硫酸盐中析出，而白蛋白需在70%—80%饱和度才析出，因此常用33%饱和度的硫酸胺纯化血清中的IgG。盐析时为了减少抗体变性，需在4℃进行，同时用pH8.0缓冲液稀释抗血清，以减少蛋白浓度过高而发生共沉淀。铵盐的溶解度不随温度变化而明显改变，0℃和25℃仅差3%，而钠盐则相差5倍，因此常在低温沉淀时用铵盐，室温沉淀用钠盐。铵盐对抗体的标记反应（如FITC和biotin标记时）有一定的干扰作用。

盐析法只能部分纯化抗体，更高纯度的抗体制剂可用层析法制备。IgM五聚体相对分子质量达9.7×10，比血清中任何其他蛋白都大，用分子筛层析很容易将其纯化。IgG在PH 8．0时带负电荷，能与DEAE纤维素上的阳离子结合，因此可用离子交换层析来纯化IgG。IgG纯化最常用的方法为亲和层析。IgG与葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白具合高度的亲和性，可用这两种蛋白质交联亲和层析柱将IgG纯化。大部分IgG与蛋白A结合PH为8—9，洗脱PH为2—4；而与蛋白G的结合PH为5—7，洗脱PH为9—10。C蛋白更适合于IgG的纯化，不但反应条件为温和的弱酸性或弱碱性，并且与IgG的结合力高于A蛋白。G蛋自能与大部分动物种类的IgG结合，而A蛋白对小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、马和绵羊IgG结合力弱或不能结合G蛋白和A蛋白均不能与鸡IgG结合。

抗血清或纯化的抗体在低温保存可维持活性数年，反复冻融使抗体很快失活，被细菌或霉菌污染的抗血清或IgG制品也易失去活性。稀释的抗血清加入防腐剂叠氮化钠和保护剂如BSA等可于4℃保存。长期保存常用等量甘油于—20℃以下冷藏。也可置于 50%饱和硫酸铵中4℃保存，还可以冷冻干燥保存。 根据不同目的制备的抗血清，对其中所含抗体的浓度，特异性及免疫球蛋白种类的要求也不一样。为了获得质量和数量上合符要求的抗血清，在收集动物血清前必须对免疫效果进行检测，对收获后的抗血清也必须对—些参数进行分析，如效价、亲和力及交叉反应等。根据不同的抗原性质选用合适的检测方法。最常用的为免疫沉淀，ELISA，放射免疫等。

效价又称滴度（titer），是常用于表达抗血清中特异性抗体相对含量的—个半定量指标，即在给定的条件下，结合—定量抗原的抗血清的稀释度。抗血清经一系列稀释后（如倍比稀释）与定量的抗原反应，以能检测抗血清最大稀释倍数即为该抗血清的效价。不同的检测方法测定同一种抗血清的效价，灵敏度不一样，抗血清的效价也不一样，如沉淀反应（琼脂双扩散）与ELISA二者的效价相差甚大，后者远高于前者。放射免疫分析（RIA）常用于标记小分子抗原来检测抗血清的效价。

亲和力（affinity）表示抗血清与相应抗原的结合强度，是描述抗体持异性的重要指标，

常用亲和常数K表示。亲和常数K与抗原抗体反应的平衡常数有关：

抗体特异性与交叉反应：抗体是特异的。只与相应抗原反应。实际制备的抗体却常有非特异性反应，这是因为抗原不纯造成的。多组分抗原之间存在共同的抗原决定簇，或者两个抗原决定簇结构类似能与同一抗体结合，均可出现抗体与异源抗原的交叉反应。用琼脂双扩散能简便直观地反映不同抗原与同一抗血清，或不同抗血清与同一抗原的交叉反应。 原理1：单克隆抗体（MAb）与抗血清（又称多克隆抗体，PAb）最主要的区别是MAb为单一种B细胞克隆所产生的一种均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B细胞克隆的标志，是一种独特型的抗体，它的特异性是针对一个抗原决定簇的。制备单克隆抗体不能用化学分离的方法从多克隆抗体中去分离纯化得到它，而是用分离产生抗体的B细胞克隆的方法得到它。为了使B细胞克隆能在体外人工培养下长期存活并产生完全均一的MAb，G．K&Oumlhler合Milstein于1975年创立了杂交瘤方法。所以制备单克隆抗体的技术又称杂交瘤技术（hybredoma technique）。

杂交瘤技术的基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交。筛选得到的杂交瘤细胞应该是既能分泌抗体又有瘤细胞的特性，可长期传代培养，又可在液氮中保存的细胞。把这些细胞单克隆化，用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产。

原理：最常用的单克隆抗体是小鼠的单抗，此外也有大鼠的和人源的单抗。人源单抗制备比较复杂。小鼠单抗的制备通常是使用Balb/c小鼠的B细胞和它的骨髓瘤细胞。大鼠的单抗制备通常用Lou/c大鼠及其骨髓瘤和Y3/AO大鼠及其骨髓瘤细胞。B细胞是从免疫动物的脾脏中分离出来的。动物免疫方法与抗血清制备相同，只是在制备脾脏前3d必须进行一次静脉加强注射以保证得到的B细胞有旺盛的分泌抗体的活性。骨髓瘤细胞有许多细胞株是经过诱变和筛选得到的缺陷型。筛选的标准是①瘤细胞本身不产生抗体或者产生抗体的某种链，但不能分泌；②是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型。因为这种缺陷型的瘤细胞正常的核酸合成途径被氨基喋吟（aminopterin）阻断后，由于缺失这些酶，即使补充它的底物次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T），核酸合成的旁路也不能起到救援的作用，结果导致瘤细胞死亡（图7—2）。而杂交瘤细胞因带有B细胞的全套基因，在HAT存在的条件下借助于HGPRT和TK的作用通过替代的核酸合成途径能正常合成DNA和RNA。所以杂交瘤能正常地生长繁殖而被选择出来。未被融合的游离的B细胞只能存活3d而后自行死亡。这就是用HAT培养基进行选择的原理。 （1）融合：细胞杂交之前，要分别准备好脾脏的B细胞悬液和小鼠骨髓瘤细胞（如SP2/0—Agl4细胞株）。免疫后的小鼠脾脏在无菌条件下破碎，将B细胞悬浮在没有血清的培养液中（通常使用RPMIl640商品配制），并洗涤3次去掉小鼠的血清。SP2/0细胞是用加有10%胎牛或小牛血清培养的，每天更换新鲜培养液使成为对数分裂期生长旺盛的细胞。细胞用RPMIl640洗涤2—3次，把两种细胞合并在同—试管中，用50%的聚乙二醇（相对分子质量为1000—1500）作为融合剂，在37℃条件下融合l—2min。然后用1640培养液缓慢稀释，然后除去PEG，将细胞分散至HAT选择培养板中。电融合方法也可用于单克隆抗体制备，虽融合率较高，但一次融合的细胞数少，且需专门设备，故限制了其广泛使用。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例在5：1—10：1均可获得满意结果，每次融合细胞数量在10—10较为合适。融合后的细胞在40或96孔板上的HAT培养液(RPMIl640含10%—20%胎牛或小牛血清和HAT）中37℃，5%CO2条件下培养。融合后的细胞悬液中只有脾细胞和骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞能在HAT培养基中生长，其他形式的融合细胞均不能生长．未融合的细胞也不能在HAT培养液中生存。

在融合后的细胞培养过程中，饲养细胞（feeder cell）有助于杂交瘤细胞的生长。饲养细胞可用同种动物的腹腔细胞或胸腹细胞。腹腔细胞中的吞噬细胞能清除死亡细胞碎片。使背景更为清洁“干净”。同时饲养细胞分泌的细胞因子或活性物质有助于杂交瘤细胞的生长。现有商品“杂交瘤细胞生长因子”可用于替代饲养细胞。

（2）阳性杂交瘤细胞的筛选与单克降化：杂交细胞经约10—14d培养后，形成可用的细胞集落（克隆）。经过几次更换培养液（HT培养液）后进行抗体活性检测。常用的筛选枪测方法是ELISA和凝集试验，前者常用于可溶性抗原，后者适用于细胞、细菌等表面抗原。此外，Dot－ELISA、免疫印迹及免疫荧光试验均可用于杂交瘤细胞的筛选。

使许多细胞克隆混合生长的细胞分离为单个的细胞克隆的过程称克隆化（colonization）最常用的单克隆化方法是有限稀释法（limited dilution），即将混合细胞经稀释后分装于培养板上，使培养板的大部分孔中只出现一个细胞。为了确保抗体分泌细胞来源于单个细胞，克隆化过程可重复进行，称为亚克隆化（subclonization）。除有限稀释法外，荧光激活细胞分拣法（FACS）也用于杂交瘤细胞的克隆化过程。 产生特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株应立即扩大培养，以获得足够的细胞用于保存和生产可供应用的抗体。生产大量单克隆抗体的方法目前常用的有3种：小鼠腹水制备、大瓶培养和中空纤维反应器，前者多用于实验室制备，后二者适应于工厂化生产。

腹水制备：杂交骨髓瘤细胞在腹腔中定植，并产生大量腹水。选用与单克隆抗体制备所用相同的动物品系或者含有相同基因的Fl代杂交品系。杂交F1代品系更适合于腹水制备，如果用异源动物制备腹水时可选用无MHC限制性的裸鼠。用小鼠制备腹水时，先用矿物油或Pristane致敏，以抑制其免疫功能，利于腹水的形成。腹腔注射10—10个杂交瘤细胞，经过7—10 d后形成腹水。每只小鼠可获得3—5mL腹水，每mL含IgG抗体可达5—10mg。腹水中含有较多的杂蛋白和非特异性IgG，并且含有许多蛋白酶，易使抗体失活，因此腹水收集后应尽快纯化，以防止降解。

大瓶培养：采用1000mL或更大的摇瓶培养。大瓶培养上清体积大，但抗体浓度低，给抗体纯化带来很大困难，消耗人力和培养液，增加生产成本。

中空纤维反应器：是比较经济的单克隆抗体生产方法。该装置由具有半透膜性质的成束的微孔纤维组成，杂交瘤细胞位于纤维外部的小量培养液中，培养液在纤维的微孔中循环，供给营养和带走废物，抗体大分子和小分子化合物被隔开。高密度的杂交瘤细胞能在此系统中维持数月，每天可产生数百毫克的抗体，抗体浓度高，体积小易于纯化。

胎（小）牛血清一直是细胞培养所必须的，在单克隆抗体生产过程中培养液中的血清蛋白使抗体的纯化增加了困难，近年开发的无血清培养技术已逐渐用于单克隆抗体的生产中。 小鼠的单克隆抗体蛋白应用于人体后，作为抗原能引起人的免疫应答，大大降低其生物活性，并可能导致变态反应。因此人源单克隆抗体在临床治疗上有广泛应用前景，引起人们的普遍兴趣。但是人单克隆抗体制备存在许多技术上和伦理上的障碍，如人杂交瘤细胞系不稳定，有些抗原不能对人进行人工免疫，人B细胞只能从外周血中分离而无法从脾脏取得等。尽管如此，一些人源单克隆抗体已经获得，技术上也在逐步完善起来。

人的瘤细胞株U—266常用来与人外周血B细胞融合以获得人源单克隆抗体。另一些淋巴母细胞抹（LCL）则来源于EB病毒转化的淋巴细胞，如GMl500，W1—L2和ARH77等也用于杂交瘤细胞的制备。这些细胞系表现ED病毒核抗原（EBNA）阳性，且形成的杂交瘤细胞抗体的分泌水平不高。

获得人单克隆抗体的另一方法是用EBV直接转化某些抗体分泌细胞，使之成为“不死”的细胞在体外培养。EBV感染人B细胞后，病毒基因插入人B细胞基因组中，有1%的细胞转化为“不死”的细胞。B细胞转化可通过“病毒驱动”和“细胞驱动”两种方法获得。前者是将B细胞与分泌EBV的B95—8细胞系一同培养，后者则是与EBNA阳性的LCL细胞一同培养。“细胞驱动”转化的B细胞比较稳定，抗体分泌能力也较强。

人淋巴母细胞系和人杂交瘤细胞较难获得，人单克隆抗体也可以通过异源杂文的办法制备，即将EBV转化的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，将获得的异源杂交瘤细胞再与免疫后的B细胞融合，得到人单克隆抗体分泌细胞，不产生自身免疫球蛋白，EBVA也是阴性。 抗体的化学修饰：

抗体Fc段用双功能连接剂与荧光素，同位素，酶，发光化合物，稀土元素以及药物，毒素等连接后，并不影响其Fab功能区与特异性抗原结合。根据交联物的性质不同，标记的抗体可用作诊断试剂，也可作为药物的定向载体，引导药物或毒素到达抗原存在部位使药物或使毒素发挥更有效的作用，即俗称“生物导弹”。从而减少药物、毒素、同位素、酶在肿瘤治疗过程中引起严重的副作用，大大提高治疗肿瘤的效果。

许多毒素如蓖麻毒素，白喉毒素，天花粉，红豆毒素等均为蛋白质或糖蛋白，可用双功能剂与抗体相连；吗啡，前列腺素，氨甲喋吟，磷酸酯酶C等含有羧基能用碳二亚胺（EDC），混合酸酐法与抗体的氨基形成酰胺键；同样，含脂肪胺的药物如庆大雷素，阿霉素在水溶性EDC的作用下与抗体的羧基连接；而含芳香胺的药物则先在低温下与亚硝酸作用形成重氮化合物，再与抗体分子上的酪氨酸或组氨酸残基形成偶氮键。总之通过抗体的化学修饰把抗体的特异性用到定向给药和定位检测上。 抗体基因文库（antibody recombination library）是将不同的重链和轻链基因随机组合，克隆到合适的表达载体中，在原核细胞表达不同的抗体，形成一个抗体库，从这个抗体库中，用抗原可以筛选到相应的抗体基因。抗体基因来源于杂交瘤细胞或动物B细胞（免疫或未免疫）的DNA和mRNA。

用质粒作为抗体文库的载体，虽然也可能表达有活性的抗体分子或片段，但由线状噬菌体表达更为方便有效。M13、fd、F1等噬菌体的外壳蛋白由5种蛋白组成：pⅢ、pⅥ、pⅦ、pⅧ和pⅨ。每种含量不一，其中pⅧ含量最多，每个噬菌体有2700个pⅧ亚基，其余4种蛋白仅5个拷贝。增加噬菌体外壳蛋白的长度并不影响噬菌体的装配，抗体以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面。噬菌体表达质粒常用的有fd－CAT1、fd－tet－DOG1、PHEN1、pComb3和pComb3H等。抗体融合蛋白构建多用pⅢ和pⅧ，pⅧ拷贝数高，低亲和力的抗体蛋白容易筛选出来。

在噬菌体表达抗体时，常常不表达完整的抗体分子，（因为CH2上不能进行糖基化）。根据不同的引物得到重链的VH或VHCH1区，轻链的VL或VLCL区。VL和VH两个片段用一短肽作连接片段，形成单链可变区（single－chain fragment variable，scFv）；VHCH1和VLCL两片段则形成Fab片段。另外，单独的VH和VL也能结合抗原，如果二者形成同源或异源二聚体（dAb），则稳定性和亲和性明显提高（图7—4）。此外在抗体片段DNA末端加上一些功能蛋白（如碱性磷酸酶和蛋白毒素）的基因，则表达的抗体就带有一定生物活性功能片段，可用于检测或治疗。如果在抗体基因末端加上终止子（TAG）则表达的抗体片段是可溶性的，而不是结合在噬菌体表面。

用特异性抗原免疫的动物B细胞构建抗体的噬菌体文库，抗体亲和性高，用与免疫抗原不同的抗原筛选得到的抗体亲和性普遍较低。可用模拟天然体细胞突变的方法来提高亲和力。如混杂重组法，即将己获得的轻链或重链的V片段切下，再克隆至随机的文库中的V区构成二级文库，使H链和L链混杂，可以使抗体片段的亲和性提高。利用PCR错配将随机突变引人至抗体的抗原结合区，也能提高对抗原的亲和力。先用低亲和力的载体在噬菌体的PⅧ表达，筛选后、将抗体基因片段PCR扩增转至PⅢ上表达，可获得高亲和力的抗体片段。

抗体基因文库有两个优点，一是从不适合进行人工免疫的物种获得单克隆抗体，如人源单克隆抗体；二是可快速方便获得单克隆抗体。 将鼠源抗体的V区基因与人源抗体C区基因重组，获得的嵌合抗体（chimericalantibody），可保留鼠抗体对抗原的高亲和性，又减弱鼠源抗体对人的免疫原性，提高治疗性抗体的效果。

重组的嵌合抗体基因转化骨髓瘤细胞或中国地鼠卵细胞（CH0），可在其中表达。为了进一步地消除鼠抗体V区框架区（FW）的异源性，可实行CDR移植（CDR grafting），以获得与鼠FW类似的人FW结构的嵌合抗体。

噬菌体表达的抗体仅含V区（scFv）或Fab片段，缺乏Fc区，使抗体的稳定性下降，半衰期缩短，与Fc受体结合功能也消失。因此在抗体功能片段的末端连接A蛋白、酶、细胞因子、CD4和毒素等分子，既可增加抗体片段的稳定性，又可发挥某些生物学活性功能。

用抗体基因工程方法获得的抗体与效应分子交联物比用化学交联法具有优点：可以大量生产，不会因修饰作用影响抗体及效应分子的活性，效应分子还可根据需要进行改造。

此外在抗体片段的末端连接一段特异的双亲性螺旋（amphiphilic helixes）结构，如亮氨酸拉链结构（leucine zipper），可使单价的scFv或Fab片段在体内或体外形成稳定的双分子聚合体，从而提高抗体片段的亲和力。此法也可用于制备双特异性抗体。 噬菌体表达的抗体片段常常是在原核细胞（E.coli）中完成。原核系统表达抗体片段产量

高，成本低，快速易于操作。但抗体片段在原核表达系统中不能进行CH2糖基化，从而影响抗体的活性。因此重组抗体基因片段可转移至适合的骨髓瘤细胞系或哺乳动物细胞系（如CHO），甚至于植物细胞中表达，可以得到与淋巴细胞表达相同的抗体分子。免疫球蛋白IgA的重链和轻链及分泌片基因可以分别转化不同的植株，将表达这些蛋白的植株进行有性杂交，在杂交后代中可以装配成完整的IgA双分子。以植物作为生物反应器进行抗体的表达已有许多成功的研究报道，与动物细胞相比更为经济，具有广泛的应用前景。 抗体酶是抗原决定簇处于转换态结构的抗体。因为转换态分子极不稳定无法制备抗体，所以催化性抗体的获得主要是通过设计稳定的转换态的类似物作为半抗原，与载体蛋白交联后，免疫动物，获得针对半抗原的抗体，从中筛选具有催化活性的抗体。筛选催化性单克隆抗体所用的ELISA与筛选一般抗体的方法不完全一样，应根据催化反应的特点而进行适当的修改。经典的方法是先筛选出与底物或半抗原结合的抗体，然后从中再筛选出有催化活力的抗体，这种方法费时费力。利用催化性抗体对底物的催化活性，对底物进行适当修饰，使催化反应的产物可直接表现抗体的催化活性，这样可以简化检测步骤。

转换态类似物半抗原的设计，必须了解催化反应的转换态模型的结构特点。催化抗体的抗原结合位点上与转换态互补的某些催化基团的形成，能稳定转换态分子。此外有人把单克隆抗体分子用化学修饰方法引入一些活性基团，提高催化性抗体的催化与亲和效率。应用噬菌体抗体文库也可以筛选催化性抗体，可省去制备转换态类似物的复杂过程，直接用底物从文库中筛选有催化活性的抗体片段。如用半抗原免疫后制备的文库或文库经过多次混杂重组，则可以得到更高的亲和力的催化性抗体。抗独特型抗体也用于催化性抗体的制备，用酶作为抗原免疫小鼠获得能够封闭酶活性位点的单克隆抗体，将这个抗体用蛋白酶除去Fc片段，用Fab免疫其他品系的小鼠或家兔，得到的抗体具有相应的酶催化活性。

从理论上看，B细胞具有全套免疫球蛋白的多样性的胚系基因，当然也包括有催化作用的自身抗体在内。然而1989年Paul W.首次报道了人体的一种能催化蛋白质水解的免疫球蛋白。它是—种自身抗体，能水解血管活性肠肽（vasoactive intenstinal peptide，VIP）的Glnl6—Met17键。用VIP作为抗原能得到有催化作用的单克隆抗体，也能催化Glnl6—Met17键。大约有17%的人有这种自身抗体酶，但患有气喘的病人中该抗体与VIP的亲和力比健康人高50倍。由于VIP是一种气管松弛剂，因此有人认为这种VIP自身抗体的长期作用可能与气喘的过敏应答有一定关系。由此推测除了人工设计催化抗体以及发现的自身催化抗体外，用筛选单抗的方法，也有可能找到所需要的催化抗体。

第二章 抗体制备技术

抗体的基本概念：多克隆抗体（多个淋巴细胞克隆所分泌的抗体）和单克隆抗体（单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体）

单克隆抗体的特点：

高度均质（同一亚类），化学组成均一，不含或很少含Ig

特异性强，只针对某一种抗原表位

亲和力强

抗原用量少，无须纯化

无批间差异

来源稳定，可达批生产，容易标准化

不易形成沉淀线

操作比较麻烦

什么条件下需要制备单抗：

目的蛋白有类似的结构

抗原不纯，无法分开

多抗的效果不好（已经排除非特异性反应）

希望将抗体用于治疗，研制成药物

希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂。

第一节   多克隆抗体的之别

一、多克隆抗体制备的原理

抗体制备、动物免疫、抗体纯化

二、多抗的基本条件

1.   免疫原的制备

颗粒性抗原：细胞、病毒、细菌等，一般具有较强的免疫原性，可以不加佐剂，直接进行腹腔注射。

可溶性抗原：可溶性抗原的来源主要是天然纯化，或者用目的基因在原核细胞或者真核细胞中表达，可溶性抗原需要与弗氏佐剂完全或不完全混匀，才可以进行免疫。

（1） 完全抗原的提取：细胞破碎法、抗原提取、抗原的纯化

（2）半抗原与载体的交联：载体的选择、半抗原与载体偶联的方法、偶联复合物的鉴定

（3）合成肽抗原：免疫原性肽的选择、肽的合成和纯化

2. 免疫动物的选择：

3.   佐剂的准备：

佐剂的种类：无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂、油剂

三、多克隆抗体制备的基本方法

1.  抗原计量、免疫途径与免疫日程

免疫动物的方法：

免疫原值被：

无佐剂免疫法：适用于颗粒性抗原

弗氏佐剂免疫法：适用于可溶性抗原

铝佐剂免疫法：适用于人的免疫

免疫动物（一般选择雌性动物，温顺并且可以生产）

皮内免疫法

皮下或肌肉免疫法

淋巴结免疫法

混合法

抗体效价满意后静脉注射加强免疫

常见的注射方法；皮下注射、皮内注射、尾静脉注射、静脉注射

2.   小样试血与采血

抗血清的获得：眼眶取血、颈动脉放血、心脏采血

免疫效果评价：取血（兔耳动脉、鼠尾静脉）、检测（双向免疫扩散、ELISA）

3.   抗体的分离和纯化技术

盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析、亲和层析法、电泳分离法

亲和层析法原理：利用蛋白质之间的特异性结合（抗原-抗体、受体-配体）将一种配基与凝胶颗粒结合，捕捉与他相配的物质，洗脱另外一种物质，并且洗脱一般用改变pH的方法。

主要步骤：将蛋白质与活化柱子结合，将腹水或者血清处理后过柱子，用结合缓冲液洗柱子（知道A280为零），永安氨酸缓冲液洗脱抗体，等量收集洗脱液，测定洗脱液的A280值，保留A280值明显升高的样品。

4.   抗体的鉴定

蛋白质浓度的测定：紫外分光比色法、双缩脲法、福林酚法、

免疫效果评价：双向免疫扩散、ELISA

纯度分析：免疫印迹（WB）

抗体类别分析：免疫金试条

亲和力分析：ELISA、荧光偏振

5.  抗体的保存

抗体的浓缩：吸收、蒸发、超滤

抗体的保存：浓缩抗议+甘油+防腐剂

免疫效果不佳的原因可能是：抗原纯度不够、免疫原性低、免疫途径乳化不合格、免疫剂量不合适、动物疾病或者种属差异小。

第二节  单克隆抗体制备技术

一、单克隆抗体制备的原理

1个B细胞只能产生1个抗体。方法是细胞工程杂交技术和B细胞杂交瘤技术

需要将单克隆B细胞和肿瘤细胞相结合才可以永久产生单抗

Barski等发现细胞额自然融合现象，但是频率很低

冈田等发现灭火的仙台禀赋和聚乙二醇能显著提高细胞融合的效率。

二、单抗制备的基本条件

需要培养正常的B细胞以及B细胞融合的肿瘤细胞

1.   动物的免疫抗原与载体、动物的选择、免疫途径

举例：小鼠免疫

第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐剂——小鼠背部皮下注射（4周后）

第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐剂——小鼠背部皮下注射（3周后）

第三次免疫：可溶性抗原加生理盐水——小鼠腹腔注射（10天后检测血清效价）

加强免疫：可溶性抗原加生理盐水——小鼠腹腔注射（3天后）

细胞融合

2.  酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养

细胞DNA合成途径：

次黄嘌呤（H）通过嘌呤合成跑路途经合成HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）进一步合成鸟嘌呤核苷酸

胸腺嘧啶核苷（T）通过嘧啶合成旁路途经合成TK（胸腺嘧啶核苷激酶），进一步合成胸腺嘧啶脱氧核苷酸

氨基酸、谷氨酰胺、鸟核苷单磷酸通过核酸生物合成主要途径结合上面两步合成的鸟嘌呤核苷酸以及胸腺嘧啶脱氧核苷酸形成DNA

将第三步当中氨基端变为氨基碟呤（A），则无法形成DNA。

因此酶缺陷型细胞的筛选就是HAT筛选

3.   单抗检测方法的建立

免疫酶技术

免疫荧光技术

免疫扩散技术

三、单抗制备的基本方法

1.   酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养

组织培养的基本条件：

仪器：包括CO2培养箱、倒置显微镜、超净台、液氮罐、低速低温离心机

试剂：培养液、HAT选择培养液、HT培养液、血清、抗生素

耗材：培养板、培养品、吸管、移液管

骨髓瘤细胞系的选择要点：

（1）  所选的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物品系相同

（2）  自身不产生免疫球蛋白的重链和轻链

（3）  对氨基碟呤敏感

（4）  与免疫脾细胞融合后产生稳定分泌的Ig杂交细胞

2.   饲养细胞的制备

饲养细胞的作用：

（1） 增加细胞浓度，满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的要求

（2）  吞噬清楚死亡的细胞

（3）  分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞的生长

饲养细胞的种类和制备方法

（1）  小鼠腹腔巨噬细胞

（2）  小鼠脾细胞

（3）  成纤维细胞

3.     脾细胞的分离

（1）  拉颈椎处死小鼠

（2）  无菌操作取出脾脏

（3）  清洗、研磨

（4）  收集细胞

（5）  离心洗涤

（6）  细胞计数

4.     细胞融合：骨髓瘤细胞和脾细胞按照1:10或1:5的比例混合并加入促融剂PEG

细胞融合的方法：PEG融合、仙台病毒、电融合

5.    HAT选择性培养

       HAT选择性培养的原理：细胞的DNA生物合成右主要途径和补偿途径。当A存在是，能够阻断DNA合成的主要途径，须通过补偿途径合成DNA，这时就需要HGPRT利用H合成DNA，或者TK利用T合成DNA。

       由于选用西黄嘌呤鸟嘌呤荷塘转移酶缺陷型（HPRR-）骨髓瘤在细胞或者胸腺嘧啶割肝激酶缺陷型（TK-）细胞作为亲本，该校只能通过群全条件的DNA培养基才可合成，因此杂种细胞通过互补作用获得HGPPT或者TK基因。只有杂种细胞可以活，酶缺乏性细胞完全无法存活，单克隆B细胞一般不能长期生长，就起到了分离杂交细胞的作用。

       细胞生长情况：融合3-4天之后，可以看到刑诉骨髓瘤细胞，混元透亮的克隆。融合后第7-9天去培养上清，检测特异性抗体。

       筛选后存活的细胞就是脾细胞和骨髓瘤细胞融合细胞。

6.     阳性克隆的筛选

分泌单克隆抗体杂交瘤细胞的检测方法

免疫酶技术：简介ELISA法

免疫荧光技术：间接免疫荧光测定法、流式细胞分析技术（阴性对照：骨髓瘤细胞培养上清，阳性对照：免疫鼠血清）

7.     克隆化培养：阳性细胞的单克隆化

克隆是指由单个细胞繁殖、扩增而形成的性状均一的细胞集落的过程。

常见方法有：有限稀释法和软琼脂克隆技术

有限稀释法：从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞。

软琼脂克隆技术：从阳性分泌孔中收集杂交瘤细胞，一适当浓度杂交瘤细胞加入到软琼脂培养基中，形成有一个细胞增殖来的细胞集群。

单克隆抗体的鉴定：

（1）  抗体敏感性检测：对腹水和培养基上清进行效价测定

（2）  抗体特异性鉴定：是否与其他抗原右交互反应。

（3） 抗体效价测定

（4）  抗体亚类鉴定：IgG（IgG1、IgG2、IgG3）、IgM

（5）  抗体亲和力鉴定

（6）  识别表位分析

8.    单克隆抗体的扩大生产：细胞培养法、小鼠体内诱生法、生物反应器

细胞培养法：杂交瘤细胞、培养瓶或罐中培养、收集上清液、纯化抗体

动物体内诱生法：Balb/c小鼠、腹腔注射0.5ml液体是啦或降植烷、腹腔内接种杂交瘤细胞、收集腹水

生物反应器：发酵罐培养

单抗培养常见的问题：

（1）  污染：培养环境、操作

（2）  融合细胞不生长：PEG、血清、HAT培养基

（3）  抗体分泌不足：支原体污染、细胞突变、培养体系有问题

（4）  杂交瘤细胞难以克隆化：血清质量、细胞活性

第三节  基因工程抗体制备技术

基因工程抗体：通过基因工程的手段，按照个人意愿进行细胞人工改造的技术。

优点主要有：特异性高、质量稳定、成本低廉、工艺简单、异源性滴低、穿透性好、功能丰富。

一、鼠源抗体人源化

鼠源抗体应用中的障碍：免疫原性、半衰期短、抗体功能片段失活。

1.     嵌合抗体：可变区基因克隆、表达载体的构建、嵌合抗体的表达

2.     改型抗体

二、小分子抗体：Fab抗体、Fv抗体和单链抗体、单域抗体、最小识别单位

小分子抗体的优点：

（1）可在原核体系中表达，降低生产成本。

（2）因为其分子量小，穿透能力强，易进入病灶部位，有利于对肿瘤等疾病的治疗。

（3）不含Fc片段，不与Fc受体结合，可减少因广泛分布的Fc受体而带来的不利影响。

（4）在体内半衰期短，有利于体内毒性物质的消除

（5）易于进一步基因工程分改造。

三、]基于抗体的应用

1.     CAR-T免疫治疗：

       CAR-T免疫疗法：即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种新型的过继性细胞疗法，即利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞的细胞疗法，并非药物。

       CAR-T技术：通过整个嵌合抗原受体的经过基因修饰的T细胞抵抗肿瘤细胞的疗法。嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原或者肿瘤特异性抗原，识别结合后将激活及增值信号传递到T细胞内，引起T细胞激活，增殖释放细胞因子，从而杀伤肿瘤细胞。

2. 免疫检查点

3.  免疫毒素

4.  ADC

5.  双特异性抗体

第四节  [endif]抗体库技术

抗体库技术：即用基因克隆技术将全套抗体轻重链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体上，通过原核系统直接表达有功能的抗体分子片段，并筛选出特异性的抗体分子和可变区基因。

一、噬菌体展示技术原理：噬菌体展示技术是将外源蛋白质或者DNA序列查到噬菌体外壳上的适当位置，使外源基因随着外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随着噬菌体的重新组装而展现倒是菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已经靠发出单链丝状噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统等。

二、噬菌体抗体制备的基本程序

1.     收集淋巴细胞提取mRNA并转录到cDNA或直接提取斯堡基因组的DNA

2.     扩增DNA的抗体可变区基因

3.     [构建重组噬菌体库

4.     筛选所需特征的重组噬菌体

5.     采用突变或链置换使亲和力成熟

三、噬菌体抗体技术的特点

1.     筛选步骤简单、快速、有效

2.     扩大了筛选流量，一次就可以筛选多于1010个的克隆

3.     抗体基因型与表现性联系密切，基因稳定且容易改造

4.    模拟天然免疫系统亲和力成熟过程

5.     无需人工接种

6.     可替代动物多克隆抗体

7.     构建康体苦时。轻重链可变区基因在体外随机组合，可产生体内部存在的轻重链组合，得到新的特异性抗体。

8.     可以在预案和系统中表达，大规模生产方便，且成本低。

四、抗体库技术的应用

1.     制备全人源抗体

2.     改良基因工程抗体

人工抗原 用化学合成法或基因重组法制备含有已知化学结构决定簇的抗原, 称之为人工 抗原.它可包括人工结合抗原、人工合成抗原和基因重组抗原.无论对免疫学理 论研究和分子疫苗的制备都具有重要意义. (一)人工结合抗原 将无免疫原性的简单化学基团与蛋白质载体偶联, 或将无免疫原性的有机分子 如二硝基苯(DNP)或三硝基苯(TNP)与蛋白质载体结合,形成载体-半抗原 结合物,均属人工结合抗原.应用此种抗原证明了抗原与抗体特异结合的化学基 础,以及在抗体生成过程中 T 与B细胞的协同作用. (二)人工合成抗原 用化学方法将活化氨基酸聚合,使之成为合成多肽,只由一种氨基酸形成的聚 合体称为同聚多肽,如由左旋赖氨酸形成的共同聚多肽(PLL).由二种或二种 以上氨基酸形成的聚合多肽称为共聚多肽,如由酪氨酸、谷氨酸与多聚丙氨酸和 赖氨酸组成的聚合成多肽(T、G)-AL.应用这种人工合成多肽可研究氨基酸种 类、序列与蛋白质抗原性及免疫原性的关系,也可研究机体遗传性与免疫性的关 系. 对天然蛋白质抗原性的研究证明,任何一个氨基酸片段,只要具有合适的构型, 都有抗原性,甚至一小段合成的小肽与合适的载体相联接,也能诱导产生抗体, 并能与其天然分子构型相结合,这就提示,可根据天然蛋白质抗原的免疫原性片 段进行氨基酸序列分析,或由其编码 DNA 推导的氨基酸序列,进行构建人工合 成多肽疫苗. (三)基因工程抗原 近年来由于分子生物学技术的进步, 已有可能将编码免疫原性氨基酸序列的基 因克隆化并与适当载体(如细菌粒或病毒)DNA 分子相结合,然后引入受体细 胞中(如原核细胞的大肠杆菌或真核细胞酵母菌及哺乳类动物细胞)使之表达, 即能获得免疫原性之融合蛋白,经纯化后可做为疫苗,此即基因工程疫苗. 应用分子生物学技术制备基因重组疫苗的另一进展,是将目的抗原决定簇的 DNA 序列插入另一种比较安全的活病素基因组中(如牛痘苗),制备所谓重组 感染载体多价疫苗. 随着 70 年代分子病毒学的发展,特别是对病毒基因的结构、功能与复制方面 知识的积累,为迅速研制病毒亚单位疫苗、合成多肽苗以及基因工程疫苗奠定了 基础. 一些重要病毒如乙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒以及流感病毒等的 蛋白质多肽,都已利用基因工程进行了成功的表达,有的已进入临床试验阶段. 我国也报导了正在进行研制基因工程乙型肝炎病毒疫苗和在牛痘苗表达系统中 研制乙肝病毒的重组感染载体的多价疫苗. 能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应 、又不能单独激 发人或动物体产生抗体的抗原.它只有反应原性,不具免疫 原性,又称不完全抗原.大多数多糖和所有的类脂都属于半 抗原.如果用化学方法把半抗原与某种纯蛋白的分子(载体) 结合,纯蛋白会获得新的免疫原性,并能刺激动物产生相应 的抗体.半抗原一旦与纯蛋白结合,就构成该蛋白质的一个 抗原簇.一些比一般半抗原分子量小,但有特异结构的化学 活性基团物质( 如青霉素、磺胺剂等 ) ,称为简单半抗原. 当简单半抗原进入过敏体质的机体时,能与体内组织蛋白结 合,成为完全抗原,这种完全抗原可引起超敏反应. 半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应、又不能单独激发人或动物体产生 抗体的抗原.也就是说它只有反应原性,不具免疫原性.而抗原(全抗原)是要 同时具备这两种特性的. 但是用化学方法把半抗原与某种纯蛋白的分子(载体)结合,纯蛋白会获得新的 免疫原性,并能刺激动物产生相应的抗体,从而成为真正的抗原. 额,换句话说,就是半抗原上有抗原决定簇,但个子太小免疫细胞看不到他,跟 它结合的蛋白质够大,但上面又没有抗原决定簇.所以它们结合后就又够大有又 醒目标志了. 【半抗原交联抗体法(Hapten –Coupled techniques)】 近年来,为提高敏感性和减低非特异性染色,有些学者(Cammisuli 1976Jassani 1981Falini 1983) 在常规免疫细胞化学技术的基础上,发展了半抗原 交联抗体法,可作免疫荧光或免疫酶染色.本法的基本原理是应用半抗原标记第 一抗体.常用的半抗原有阿散酸,即对氨基苯砷酸(Arsanilic acid, ARS),对氨 基苯酰甘氨酸(P—aminobenzoyl glycine),亚对氨苯酰甘氨酸 (N—P—aminobonozyl glutamic acid)和二硝基苯氨基丙睛亚胺酸脂 (dinitrophenyl aminopropionitrile imido ester, DNP).通过酰胺化反应把半抗 原结合到抗体分子上. 在间接法 (二步法) 先以半抗原标记的特异性抗体 中, (第 一抗体) 孵育切片, 然后加入半抗原的标记抗体, (标记物可为荧光素或酶) (图6-4).在PAP 染色(三步法)中,先用半抗原标记的第一抗体孵育切片,再加 未标记的抗半抗原特异性抗体作为桥抗体,第三步加半抗原交联的 PAP 与之反 应,并作酶的呈色反应(图6-5).第一和第三抗体分别为半抗原标记的特异性 抗体和以半抗原标记的抗酶抗体制备的含半抗原的 PAP 复合物.本法具有许多 优点,主要是:①敏感性高.由于本法是通过酰胺化反应标记半抗原,对抗体活 性损失极小,抗体保留较高的活性,能结合较大量的半抗原,平均每个球蛋白分 子可同时结合 20 个半抗原分子,每个半抗原又可用抗半抗原抗体相结合,特异 免疫反应明显放大,其敏感性明显高于常规的免疫酶和免疫荧光染色技术,特别 有助于发现滴度低的同种抗血清和含抗原量较少的组织.②可用于双重免疫染 色. 利用两种交叉反应的半抗原如阿散酸和对氨基苯酰甘氨酸分别标记来自同一 种动物的两种特异性(第一抗体)血清,应用两步法或三步法,即可在同一张切 片内同时显示两种不同的抗原.③由于特异性强、敏感性高,因此背景染色低. 抗原分完全抗原和半抗原.完全抗原的本质是蛋白质或者糖蛋白,半抗原多为多 糖、脂类和一些小分子化学物质(比如青霉素),半抗原进入体内与体内蛋白质 结合后才能成为完全抗原. 抗原决定簇是抗原表面决定抗原性的特殊集团,一般为糖链、脂链或特殊的化学 功能集团.半抗原与蛋白质结合之后,原先的半抗原分子就成为了决定簇. 免疫学中与抗原偶联的载体蛋白的选择原则 免疫学中与抗原偶联的载体蛋白的选择原则 人工抗原合成常用的载体 载体表面应首先应具有化学活性基团, 这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶 联,这是化学偶联制备抗原的前提其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足 够的分子载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能而且载体应具有足 够的稳定性,且应该是廉价易得的. 常用来作为合**工抗原的载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥 孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等.这些 蛋白质分子中的 α 和ε-氨基(等电点 8 和10)、苯酚基、巯基(等电点为 9)、 咪唑基(等电点为 7)、羧基(等电点 2~4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的 β和γ-羧基)等在等电点 pH 条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核 基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合.当然,这些基团的反应性 也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境.牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋 白(HAS)分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同 pH 和 离子强度下能保持较大的溶解度.此外,这些蛋白质在用有机溶剂(如吡啶、二 甲基甲酰胺)溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用 的载体蛋白质[30].近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖 氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异 性抗体可能性增加,被广泛应用[31,32]. 1.2.2 人工抗原合成方法 小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会受到偶联物的浓度及其相对比例、 偶联剂的 有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH 以及半抗原的稳定 性、可溶性和理化特性等因素的影响.通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与 载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行.一般是由半抗 原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下: 1.2.2.1 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联 1)混合酸酐法(mixed anhydride method):也称氯甲酸异丁酯法.半抗原上 的羧基在正丁胺存在下与氯甲酸异丁酯反应,形成混合酸酐的中间体,再与蛋白 质的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物 2)碳二亚胺法(CDI):碳二亚胺(EDC)使羟基和氨基间脱水形成酰胺键,半抗 原上的羧基先与 EDC 反应生成一个中间物,然后再与蛋白质上的氨基反应,形 成半抗原与蛋白质的结合物(见图 1.5).EDC 被称作零长度交联剂之一,因为 它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子. 此连接方法十分简便,只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液 中,然后加入水溶性碳化二亚胺,搅拌 1~2h,置室温 24h,再经透析即可.如 果半抗原分子中不含羧基,可通过某些化学反应引入羧基.在引入羧基后,也可 用上述方法进行偶联. 1.2.2.2 含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 1)戊二醛法:双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形 成schiff 键(-N=C<,在半抗原和蛋白质间引入一个 5 碳桥.这一反应条件温和, 可在 4~40℃及pH6.0~8.0 内进行,操作亦简便,因此应用广泛.戊二醛受到 光照、温度和碱性的影响,可能发生自我聚合,减弱其交联作用,因此最好使用 新鲜的戊二醛. 2)重氮化法:用于活性基团是芳香胺基的半抗原,芳香胺基与 NaNO2 和HCl 反应得到一个重氮盐,它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上,形成一个偶氮 化合物(见图 1.6). 1.3.2.3 含羟基半抗原的偶联 1)琥珀酸酐法:半抗原的羟基与琥珀酸酐在无水吡啶中反应得到一个琥珀酸半 酯(带有羧基的中间体),再经碳二亚胺法或混合酸酐法与蛋白质氨基结合,在半 抗原与蛋白质载体间插入一个琥珀酰基(图1.7). 2)羰基二咪唑法:N,N'-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂,在肽合成中首 次表明了是形成极好的酰胺键试剂[33].含羟基的分子同羰基二咪唑反应,形成 中间体咪唑基甲酸酯,它能和 N-亲核试剂反应,得到 N-烷基化的甲酸酯键,通 常蛋白质通过 N-端(α-氨基)和赖氨酸侧链的(ε-氨基)和分子形成不带电的类似尿 烷的衍生物,具有极好的化学稳定性. 1.2.3 影响人工抗原质量的因素 人工抗原免疫原性的好坏,与多种因素有关.对不同的物质,影响免疫原性的因 素并不完全相同, 常常需要在得到抗体后对免疫偶合物的具体合成方法进行重新 调整.但总的说来,影响人工抗原质量的因素主要有: 1) 偶联比 偶联比过去人们认为,联接到蛋白质分子上的半抗原数目要尽可能多.但实验证 明,过多的半抗原并不能得到预期的结果,这是因为载体上覆盖的半抗原分子过 多时, 可能不利于载体与淋巴细胞表面结合, 不能使载体引起免疫反应. 实际上, 每个载体分子连接上一个半抗原分子就足以产生抗体.有人认为,以BSA 为例, 连接到蛋白分子上的半抗原数以 5~20 为宜.而荣康泰等用不同的载体制备对 氧磷的人工抗原时,却发现各种载体的分子量不论是否接近,最佳结合比都不尽 相同,并建议为了取得最佳免疫效果,应逐个确定各种载体的最佳结合比. 2) 偶联桥 有研究者认为,一定长度的手臂的介入,有助于半抗原暴露在外面,利于所产生 抗体专一性的增强,如吴颂如等〔34〕发现,通常愈远离载体蛋白的基团,其 特征反应愈明显.但也有一些研究者发现,手臂结构对免疫检测经常有不利的影 响,有时产生的抗体对手臂结构亲和力特别强,对待测小分子亲和力却很弱,因 此造成对特异性抗体检测的干扰.Sionf 等〔35〕认为可以采取两种方法来避免 因偶联桥而造成的不足:一是半抗原上相同位点结合蛋白质,但免疫原和包被抗 原用不同的偶联桥二是免疫原和包被抗原用相同的偶联桥,但与不同半抗原位 点结合.Frieia〔36〕研究农药酶免疫分析多年,他认为最好的偶联桥是 3~6 个直链的碳原子结构. 3)半抗原的分子空间结构 用来作半抗原的分子最好有分支结构,直链分子难以产生抗体.此外,有些抗生 素或农药有多个可供蛋白质偶联的位点,但据研究报道,不同位点与蛋白质结合 制备的人工抗原产生的抗体效价及亲合力都有差别, 这可能是因为不同位点结合 导致半抗原呈现的空间结构不一样的原因.如合成灭草松和吡虫啉人工抗原时, 当利用半抗原不同位点与载体结合时产生的抗体效价和亲合力明显不一样[37、 38].因此,如果一个分子内有多个不同的结合位点时,最好尽可能利用不同位 点都合成出人工抗原,然后,通过比较,筛选出最好的人工抗原用于制备抗体作 为检测. 1.2.4 人工抗原的质量评定 1.2.4.1 浓度测定 人工抗原的绝对含量常以蛋白质的相对浓度表示(如每 ml 抗原溶液中含有蛋白 质多少 mg).因此测定人工抗原的浓度与测定人工抗原溶液中蛋白质的相对含 量(mg/ml)是一致的(这里也反映出人工抗原越纯,检出的浓度值愈准确). 常用的方法有紫外吸收法、Folin-酚法、双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合 法和荧光法等.这里就不一一介绍了. 1.2.4.2 纯度鉴定和结

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