如何分离细胞核与线粒体

细胞核与线粒体的分级分离

一、原理

细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。

分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。

匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。

分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。

分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。

二、细胞核的分离提取

(一)操作步骤

1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。

2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。

3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。

4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；(3)余下的沉淀物进行下一步骤。

5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。

6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。

(二)结果

分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。

三、高速离心分离提取线粒体

(一)操作步骤

1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。

2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签)。

3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。

(二)结果

油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。

影响线粒体分离纯化的关键因素：

细胞核

线粒体分离纯化，线粒体普遍存在于真核细胞中(成熟红细胞除外)，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，细胞生命活动所需的能量大约95％来自线粒体。在肝脏、肌肉、心脏和脑组织中含量丰富。线粒体的提取普遍采用的是密度梯度离心的方法，因为线粒体的体积较小，需要较高的转速和较长的时间才能使其沉淀。在要求更高的实验中，需要使用超速离心机和密度梯度离心方法将粗提的线粒体进一步纯化。

为保证线粒体的活性，一般需要在低温条件(4℃)下操作。细胞或组织匀浆后，先低速(1500g)离心，去除未破碎的细胞、细胞核和大的碎片。将收集的上清液以12 000g离心15分钟，收集沉淀，即可获得线粒体粗提物。必要条件下可以重复一次。线粒体的纯化主要依赖蔗糖密度梯度超速离心方法获得，配制15％、23％、32％和60％蔗糖溶液，134000g离心1小时，收集60％和32％界面交界处的棕色带，可获得较纯的线粒体。

1新鲜取出的小鼠肝脏为组织块，为了得到细胞核和线粒体，首先需要进行匀浆，将细胞从组织块中分离出来，然后再经过进一步匀浆，使细胞膜破碎，细胞解体，各种细胞器被分离出来；同时，0.25mol/L蔗糖溶液，使肝脏细胞在匀浆的过程中处于低渗条件下，使得细胞更容易破碎，匀浆彻底；

2.2细胞中，各种细胞器的结构、大小、比重及在同一介质中的沉降系数都是不同的。因此，细胞器的分离，通常使用的方法是最匀浆液进行离心，根据细胞器不同的大小、比重及沉降系数，选择合适的离心方法组合，就可以将不同的细胞器进行分离，得到富集的某种细胞器。常用的细胞器离心分离技术有差速离心和密度梯度离心：

2.21密度梯度离心（density gradient centrifugation）

用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。

在实验中，我们使用的介质为蔗糖，称为蔗糖密度梯度离心法。原理是：采用不同浓度的蔗糖溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。若含有沉降系数不同的许多成分，就会出现许多层。这种情况采用适当的编排号码，取出样品池内的溶液，然后进行研究。

2.22差速离心（differential centrifugation）

差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。

2.23离心力和转速的换算公式

RCF = 1.118 × 10-5 × N2 × R

RCF表示相对离心力，单位为g

N表示转速，单位为rpm转/分

R表示离心半径，单位为cm

2.3染色方法

2.31甲基绿-派洛宁染色

甲基绿、派洛宁为两种碱性染料，与带负电和的磷酸根形成盐键。甲基绿分子有两个正电荷，易与双链DNA分子结合，使DNA显示绿色，派洛宁分子有一个正电荷，易与单链RNA分子结合，使RNA显示红色。也有人认为染色原理与核酸分子的空间构型有关。细胞核中，核仁的主要成分是RNA，而核仁外围为DNA与RNA的混合物，在细胞的不同活性状态下，外围的DNA和RNA的比例是不一样的，因此着色后的混合色也不一样，但一般情况下DNA的含量占优势，因此染色后，细胞核可以清晰地区分出被染成红色的核仁和显示混合蓝绿色的外围物质。

2.32中性红-詹纳斯绿染色

中性红是一种弱碱性 pH 指示剂，变色范围 pH6.4～8.0之间（由红变黄）。在中性或微碱性环境中，中性红的阳离子，与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。詹纳斯绿 ，常用作线粒体专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色,而在周围的细胞质中染料被还原,成为无色状态.

3.实验材料及设备

3.1实验工具设备：高速冷冻离心机、显微镜、玻璃匀浆器、解剖剪、天平、滴管、移液枪、移液管、洗耳球、镊子、离心管、小烧杯、载玻片、盖玻片、试管、吸水纸、注射器、牙签等；

3.2实验材料试剂：新鲜小鼠肝脏、生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、0.34mol/L蔗糖溶液、0.88mol/L蔗糖溶液、PBS溶液、95%乙醇、丙酮、甲基绿—派洛宁、中性红—詹纳斯绿、蒸馏水、冰块。

4.实验方法步骤及注意事项

4.1实验方法步骤：

4.11称取0.5g小鼠肝脏置于小烧杯中，用解剖剪将其剪碎，然后用生理盐水清洗数次，最后用0.25mol/L的蔗糖溶液清洗一次；

4.12将清洗好的小鼠肝脏置于玻璃匀浆器中加入1.5ml0.25mol/L的蔗糖溶液即可进行细胞匀浆，待其充分匀浆后备用；

4.13取1.5ml匀浆置离心管中，600g（3000r/min）离心10min，上清液留作线粒体分离；

4.14沉淀用1ml0.25mol/L蔗糖溶液洗涤离心2次，每次1000g（3900r/min）离心10min；

4.15纯化：将沉淀用500μL0.34mol/L蔗糖溶液悬浮，然后用注射器加入0.88mol/L蔗糖溶液400μL，1500g（4800r/min）离心15—20min；

4.16用PBS溶液悬浮——干燥——95%乙醇固定（5min）——甲基绿-派洛宁染色20-30min——丙酮分离30S——蒸馏水漂洗——吸干镜检；

4.17步骤3的上清液置离心管，10000g（12270r/min）离心10min，沉淀用预冷0.25mol/L蔗糖溶液悬浮，然后10000g（12270r/min）离心10min两次；

4.18在载玻片上滴加1-2滴中性红—詹纳斯绿，然后用牙签挑取沉淀均匀涂抹于玻片上，盖上盖玻片，染色5min即可镜检。

4.2注意事项：

4.21整个实验的操作都要在较低的温度下进行，一般需要在4度以下，以保证经过匀浆之后，细胞器能够在低活性状态下，保持比较完整的形状，所以实验的操作过程中都需要采取冰浴或者通过其他方式保持低温条件；

4.22使用离心机时应注意离心管内液体的配平；离心开始前或者离心完成后，不能保持离心机盖长时间开放，以免使离心机温度升高，影响离心效果；

4.23在对细胞核进行染色时，需要控制好甲基绿-派洛宁染色的时间，也要把握好用丙酮洗脱的时间，才能保证细胞核中的DNA能够显示甲基绿的染色效果。

4.24在进行线粒体的分离观察时，需要保证所取的动物组织是新鲜的，才能观察到明显的线粒体的形态。

5.参考文献

[1]翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学.北京：高等教育出版社，2007.

[2] 崔泳 王金生 张文海 周勇. 冷保存鼠肝脏细胞线粒体的分离[J].中国医科大学学报.2000年8月.第29卷第4期.

二、实验报告

1.实验现象及结果分析

1.1细胞核的观察

1.11现象：在显微镜下，可看到富集分离的细胞核，细胞核呈圆球形，核中央可见到两个或多个被染成红色的核仁，外围的物质被染成蓝绿色，但仔细观察，发现细胞核中蓝绿色的着色部分中混有红色

1.12结果分析：核仁中的主要成分是RNA，被派洛宁染成红色，外围物质中主要是DNA，被甲基绿染成蓝绿色，但是外围物质中同样分布有一定量的RNA，因此可看到蓝绿色中混有的红色。

1.2线粒体的观察

1.21现象：在显微镜下，可以看到呈淡黄色，透亮的块状物质，但是不能找到被染成蓝绿色的线粒体

1.22结果分析：显微镜下看到的淡黄色物质，是细胞破碎之后剩下的细胞膜脂质成分，不能被中性红染色，故呈黄色透亮状态；由于小鼠肝脏经过长期冷冻，线粒体可以已经解体或被消化，所以在实验中很难找到线粒体的染色形态

2.实验总结

在本次实验中，我学习到了细胞器分离与观察的基本方法、差速离心与密度梯度离心的基本原理、甲基绿-派洛宁和中性红-詹姆斯绿的染色机理和方法，对于以后的学习和实验都是很有帮助的；

从实验的结果上看，没有观察到着色的线粒体，究其原因，可参考文章《冷保存鼠肝脏细胞线粒体的分离》（崔泳 王金生 张文海 周勇·2000年）中得到的实验结果：4℃下保存1 h 见线粒体肿胀, 但大部分结构基本完整,轮廓和内膜嵴尚清楚。2 h 时见线粒体肿胀部分结构完整, 轮廓尚清晰, 内膜嵴不清晰, 可见空泡形成。3 h 时见线粒体肿胀结构不完整, 轮廓大清晰, 内膜嵴断裂甚至消失, 可见大量空泡形成。4 h 时见线粒体结构基本消失, 仅见线粒体轮廓…… 鼠肝冷保存超过4 h, 由于肝细胞线粒体破坏重, 仅见轮廓, 尤其在需要测定生化指标时本法不适用。为提高分离线粒体获取率。如果冷保存液改用UW 液则可获得保存时间更长的肝细胞线粒体。我们认为: 在0～4℃生理盐水保存下, 本法可以有效地分离保存3 h 以内的大鼠肝细胞线粒体。

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