高中生物单克隆抗体基础知识点
一、区别单克隆抗体和多克隆抗体
多克隆抗体：抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体。
当病原体入侵人体，能够刺激机体免疫系统产生大量的多种抗体，那么这一堆抗体就是多克隆的。
单克隆抗体(MAb)：是针专一的抗原决定簇产生的抗体，单克隆技术又名杂交瘤技术，起源于1975年，由G.KÖhler和Milstein创立。主要原理是利用产生抗体的B细胞与肿瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。
此类抗体是专一的，或者说是同一种蛋白质，因此是单克隆的。
二、杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤
(1)抗原制备
(2)免疫动物
(3)免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备
(4)细胞融合
(5)杂交瘤细胞的选择培养
(6)杂交瘤细胞的筛选
(7)杂交瘤细胞的克隆化
(8)单克隆抗体的检定
(9)分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立
(10)单克隆抗体的大量制备。
三、杂交瘤技术制备单克隆抗体的具体过程
1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
高中生物易错知识点
●使能量持续高效的流向对人类最有意义的部分
●能量在2个营养级上传递效率在10%—20%
●单向流动逐级递减
●真菌PH5.0—6.0细菌PH6.5—7.5放线菌PH7.5—8.5
●物质作为能量的载体使能量沿食物链食物网流动
●物质可以循环，能量不可以循环
●河流受污染后，能够通过物理沉降化学分解 微生物分解，很快消除污染
●生态系统的结构：生态系统的成分+食物链食物网
●淋巴因子的成分是糖蛋白、病毒衣壳的是1—6多肽分子个、原核细胞的细胞壁：肽聚糖
●过敏：抗体吸附在皮肤，黏膜，血液中的某些细胞表面，再次进入人体后使细胞释放组织胺等物质.
●生产者所固定的太阳能总量为流入该食物链的总能量
●效应B细胞没有识别功能
●萌发时吸水多少看蛋白质多少、大豆油根瘤菌不用氮肥、脱氨基主要在肝脏但也可以在其他细胞内进行
●水肿：组织液浓度高于血液
●尿素是有机物，氨基酸完全氧化分解时产生有机物
●是否需要转氨基是看身体需不需要
●蓝藻：原核生物，无质粒、酵母菌：真核生物，有质粒、高尔基体合成纤维素等
●生物导弹是单克隆抗体是蛋白质
●淋巴因子：白细胞介素
●原肠胚的形成与囊胚的分裂和分化有关
●受精卵 (未分裂)——卵裂——囊胚(以分裂)——原肠胚
●高度分化的细胞一般不增殖。例如：肾细胞有分裂能力并不断增的： 干细胞、形成层细胞、生发层无分裂能力的：红细胞、筛管细胞(无细胞核)、神经细胞、骨细胞
高中 生物 学习 方法
①预习
预习是在老师讲课前，先浏览一遍讲课内容，在浏览时，应用笔将自己认为是重点的内容划出来，将自己看不懂的内容标出来，将浏览后产生的问题记下来，有能力、有条件的还可以自己做出预习笔记。通过这样的预习，为下一步听讲奠定基础，使自己的听讲更加有的放矢，听讲时就可以对自己已经弄懂的或重点知识重新加深印象，并比较一下老师的理解与自己的理解有什么差距，如果自己理解得不深，则可以进一步加深理解。对于自己预习时还不懂的问题，则是听讲的重要内容，一定要当堂弄清楚。对于在预习中产生的问题，如果老师讲到了，则要听懂，如果老师没有讲到，一定要向老师问清楚。预习也为将来的自学能力打下了良好的基础.
② 听讲
很多优秀学生的 经验 都说明了一个共同点，即学生的主要功夫应下在课堂上。我们的学习过程，实际上是解决一种矛盾，即已知与未知的矛盾，通过学习把未知转化为已知，然后又有新的未知的出现，我们再来完成这个转化过程。而由未知转化为已知的过程是在课堂上，在老师的指导下完成的，因此应该是很顺利的。有很多学生就是课上认真听讲，在45分钟的时间里完成学习任务。但是，总有些人，课堂上不认真完成由未知向已知的转化，白白浪费掉45分钟，反而在课下再花时间去完成转化，此时已没有老师的指导，只有课本上的内容，显然是不会有好效果的。如此花双倍或更多的时间，去完成效果不好的学习任务，就是常说的事倍功半。只要我们把主要功夫下在课上，那么，课下的负担也就会减轻，而且学习效果也会提高，时间上也会更加充裕，这就是常说的事半功倍。所以，听讲这一步骤是极为关键的。
③复习和作业
每节课上，一般老师都要留一定量的作业，这些作业的内容多是讲课的重点内容，是应该认真对待的。作业的过程就是复习巩固听学知识的过程，但是，很多同学把作业仅仅当成是一种任务，甚至当成是个负担。因此，急急忙忙赶完作业，就认为当天的任务完成了，殊不知，这种做法对学习的帮助是微小的。无论课上老师是否留有作业，课下都应该先进行复习，及时将当天老师所讲的知识复习一遍，这可以加强记忆，克服遗忘。心理学家对遗忘和记忆都进行过实验和研究，德国的心理学家艾宾浩斯的实验研究成果中，提出了一个著名的“遗忘曲线”表明了遗忘发展的一条规律，即遗忘的进程是先快后慢，先多后少。就是说，刚刚学习完知识后，遗忘很快就开始，而且一开始遗忘得较多，过一段时间间隔之后，遗忘的发展越来越慢，遗忘得也就慢了。根据这一遗忘规律，我们应该进行及时的复习，不要等到遗忘得差不多时，再进行复习，那样，学习效果是不会好的。由于遗忘进程是不均衡的，所以我们复习得越及时越好。
每天的复习一定要避免机械的重复，而应抓住老师讲课的重点、知识的联系和老师讲课的思路，将老师讲课内容按照自己的理解，用语言表述一番。
通过复习，加强了记忆，然后再来做作业，可以大大提高作业的效率，作业的困难、疑问、多可迎刃而解，而且通过作业又可进一步运用所学的知识，加深知识的理解和掌握。
上海科艾博生物（COIBO）科技从大的方面说ELISA属于酶免疫技术。 免疫酶技术是将酶作为标记物，标记抗体或抗原后，与相应的抗原或抗体发生反应，通过标记酶相应底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量的检测依据。
目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），如果要分类的话，它属于异相固相酶免疫技术。所谓异相是指在检测时不需要将酶标记抗原抗体和游离抗原抗体分开，所谓固相就是指的ELISA的96孔板固相载体了。看下面均相酶免疫测定的原理图：
ELISA的主要原理很简单，有这么三个， 1、包被 抗原或者抗体能以物理性吸附于固相载体表面，可能原理是蛋白质和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原抗体反应等免疫活性； 2、标记 抗原或者抗体可通过共价键与酶连接成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特点； 3、显色 酶结合物与相应包被在固相载体的抗原或者抗体结合后，也被固定在固相载体上，加入酶的底物之后可出现显色反应，根据反应的颜色深浅可计算抗原或者抗体的相对含量。ELISA 实验设计根据检测对象的不同，我分别给童鞋们介绍抗原的检测方法设计和抗体的检测方法设计。抗原的检测设计 1、双抗夹心法 针对至少2个抗原决定簇的多价抗原。首先介绍一下抗原决定簇，抗原决定簇就是决定抗原性的特殊化学基团，也叫抗原表位，理论上一个抗原决定簇能诱导产生一种单克隆抗体（可能有童鞋又要问单克隆抗体是神马东东了，以后介绍啊）。由6－12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（线性表位）组成或由不连续的蛋白质三维结构（构象表位）组成。临床上具有2个抗原决定簇的多价抗原有很多，比较常见有HBsAg、AFP、HCG等大分子抗原。检测步骤也简单，就是包被、洗涤、加样、洗涤、加样、洗涤、显色。具体说来是先将纯化的相应抗体包被在固相载体上，再加入待测样品，若其中含有待测抗原就会与固相抗体结合，洗掉杂质后，再加入酶标记的检测抗体进行反应，洗掉多于的酶标抗体后，加入底物显色，显色与否以及颜色的深浅就代表了待测抗原是否存在以及相对含量了，简单吧。
对于双抗夹心法检测大分子抗原要注意几点，1.固相抗体和酶标检测抗体一定是分别针对待测抗原的两个不同抗原决定簇，不然两个抗体就会为争同一个决定簇而打架，会出现假阴性的不良结果；2.如果检测的样本是血清，就要注意风湿病患者体内内风湿因子RF这种奇葩异种抗体的存在，它能够神奇地结合固相抗体和检测抗体，造成假阳性的不良结果；3.包被的固相抗体含量一定是高于样品中的抗原含量，不然检测到的含量会比实际含量低；4.如果有童鞋想高端省事一些，将待测样品与酶标检测抗体同时加入固相载体，在酶标检测抗体高于样品中的待测抗原的情况下，会出现假阴性结果，这种现象书本叫钩状效应。2、竞争法 针对小分子抗原。这种方法也可以用于大分子抗原，只是相对双抗夹心法这种强悍的策略，竞争法完全没有优势，所以竞争法只在检测小分子这个边缘地带发挥余热了。临床上主要用于T3、T4、孕酮等激素以及药物等。检测步骤与双抗夹心法更简单，包被、洗涤、加样、洗涤、显色，少了一步加样的过程，但是设计上复杂一些，首先将纯化的相应抗体包被在固相载体上，然后每组样本需要分两组，一组同时加入事先混匀好的酶标检测抗原和样本的混合物，一组只加入酶标记抗原，两组颜色只差便是待测抗原的含量，有点晕啊。
对于竞争法也需要注意一点，酶标记抗原和待测样本一定要事先混匀好，然后同时加入固相载体，不然会造成不公平竞争，检测出现偏差；抗体的检测设计 就方法来说，有间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法四种设计。 1、 间接法，这个是检测抗体最常用也最简单的方法。操作步骤与双抗夹心一样，只是包被是纯化的相应抗原而不是抗体了，加入样品后洗涤，再加入的酶标记抗抗体，然后显色，颜色深浅与样品中待测抗体的浓度正相关。这个间接法的原理和步骤与双抗夹心一样一样的，为了区分就把包被抗原检测抗体叫做间接法了，以此类推，之前的双抗夹心法也可以叫做直接法，命名其实就是这么回事，规则多了就容易让人糊涂。间接法也有一些自己的特点，1.酶标记抗抗体可选择性检测抗体的亚型，可用于鉴别感染时期，如果是IgM那么提示感染早期；2.酶标抗抗体检测抗体特异性不高，容易产生假阳性，如果封闭不完全，可出现全板阳性，挺吓人的。临床上常用该方法检测抗HCV抗体、抗HEV抗体、抗CMV抗体、抗HSV抗体、抗沙眼衣原体抗体等等。
2、 双抗原夹心法，这个完全是山寨双抗夹心法的。原理和步骤也与双抗夹心一样一样的，与间接法相比，具有优越的灵敏度和特异性，但不是很常用，因为就目前的技术条件，想得到能用于ELISA检测的纯化抗原还是有一定的难度。临床上常用于检测HIV抗体初筛，TP抗体和抗HBs抗体等，这些检测对特异性和灵敏度，准确性都要求特别高。
3、 竞争法，和检测抗原设计的竞争法完全一致，临床上用的不多，我仔细总结了一下两个很具有代表性的，也各具特点。1、抗HBc抗体，检测方法与抗原相同，包被抗原之后，分两组，一组加入预先混匀的酶标抗体和待测样品，一组只加入酶标抗体，两组的显色之差可代表待测抗体的相对含量，需注意的是待测抗体与酶标抗体是同一物质；2、抗HBe抗体检测，方法与抗原竞争法设计稍有区别，包被的抗HBe抗体后，检测也分两组，一组先加入酶标HBeAg再立即加入待测样品，一组只加酶标HBeAg，两组显色之差代表待测抗体的相对含量，这种设计中包被抗体和待测抗体是同一物质。值得注意的是混合组不是事先混匀再加入，而是先加入待测抗体后再加入酶标抗原。所有的这些复杂的注意事项确实很容易把人搞晕，但是童鞋们只需要记住一条，竞争很残酷，我们就要想尽一切办法保证竞争的公平性，这样就不会错。
4、 捕获法，这种方法比较少用，由于具有识别抗体类型的优点，仅用于需要早期诊断的急性感染或者具有爆发性感染的疾病，如HAV-IgM、HBc-IgM、ToRCH等等。原理还是逃不脱经典的双抗夹心，具体方法是先包被能识别抗体类别的抗抗体，洗涤后加样品，再洗涤，加酶标记抗原，洗涤后显色，这些步骤闭上眼睛都能写出来。
最后说两句，与抗原检测不同，抗体检测的设计不是根据抗体的结构特点了，这么多种设计方法，童鞋们用的时候就会选择障碍了，掌握2个原则，1.实验要求，如果需要特异性和准确性特别高，那肯定是双抗原夹心法，要求马马虎虎，那就间接法，如果要明确抗体类型，最好的选择就是捕获法了；2.实验成本，与纯化抗体不一样，有时候想要获得纯化的抗原是非常困难的，更别说两种不同的纯化抗原了，所以双抗原夹心法临床上用的并不多。ABS-ELISA顺便说一下ABS-ELISA设计，其实是和上面说的一样的，通过亲和素-生物素系统（ABS）方法显色反应，增加检测灵敏度而已，但是增加操作步骤与实验成本，而且现在单克隆抗体的技术越见成熟，抗体特异性和亲和力大大提高，灵敏度已经不是问题，所以这些次等装备已经不常用。
结果判定最后和童鞋说说ELISA结果判定，分定性和定量两种。对于定性试验，参比阴、阳性对照的吸光度，以P/N或者S/CO比值形式报告。1. P/N比值是指（待测样本-空白对照）/（阴性样本-空白对照），一般以P/N≥2.1判为阳性，或许求知欲旺盛的童鞋会问，那么竞争法用P/N比值怎么判，呵呵，这里先不说，卖个乖，你可以百度或者私信我啊；2. S/CO比值，S是待测样本吸光度值，CO为CUT-OFF值，通常取值阴性对照平均值的2.1倍。S/CO比值≥1为阳性，竞争法S/CO比值≤1为阳性。定量检测没有什么可说的，老老实实做标准曲线，既锻炼实验操作能力，又可作为实验内部参照。
记得有这么个规定，定性检测不能目测判断，要凭借酶标仪检测，定量要在每次实验都得与待测样本相同实验条件下绘制标准曲线，有一难度，但是为了对实验负责，你就从了吧。
检验技师考点：单克隆抗体的制备原理
单克隆抗体(MAb)与抗血清(又称多克隆抗体，PAb)最主要的区别是MAb为单一种B细胞克隆所产生的一种均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B细胞克隆的标志，是一种独特型的抗体，它的特异性是针对一个抗原决定簇的。制备单克隆抗体不能用化学分离的方法从多克隆抗体中去分离纯化得到它，而是用分离产生抗体的B细胞克隆的方法得到它。为了使B细胞克隆能在体外人工培养下长期存活并产生完全均一的MAb，G.KÖhler合Milstein于1975年创立了杂交瘤方法。所以制备单克隆抗体的技术又称杂交瘤技术(hybredoma technique)。
基本原理
其原理是：B淋巴细胞能够产生抗体， 但在体外不能进行无限分裂而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代， 但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的.杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。
步骤：
一.提取合成专一性抗体的单个B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体外生长。
二.应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，得到杂交瘤细胞。这种细胞既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性
三.对杂交瘤细胞进行细胞培养，选出所需要的细胞群，体外或体内培养，从培养液或动物腹水中提取单克隆抗体
单克隆抗体的提纯
一般常用金黄色葡萄球菌蛋白A-琼脂糖4B亲和层析法。
单克隆抗体的保存 由腹水中获得的抗体,经离心去除细胞成分，再经冷冻超速离心,取上清液加0.1%NaN3，少量分装，冷冻于-70℃可保存几年。 但应避免反复冻融,否则抗体失活，特别是IgM抗体。提纯的单克隆抗体,冷冻干燥保存于2～8℃，取出时溶解后，保存于2～8℃，至少一个月内可保持稳定。腹水抗体也可冷冻干燥低温(4℃)保存两年，融化后放置4℃下保存一个月。短期使用的腹水抗体，4℃3～4 个月仍保持稳定, 培养上清加0.1%NaN3，贮于-20℃，两年不失活性。
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