rna干扰技术论文怎么写(2)

rna干扰技术论文篇二

RNA干扰技术在消化系肿瘤基因治疗中的应用

【关键词】 RNA干扰 小干涉RNA 消化系肿瘤 基因治疗

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由内源性或外源性双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)所诱发，高度特异性降解细胞内同源mRNA，使基因沉默的现象。这种现象发生在转录后水平，故又称为转录后基因沉默(post?transcriptional gene silencing，PTGS)[1]。RNAi是生物体在进化过程中抵御病毒入侵，抑制由转座子移动或重复序列的积累引起的基因组不稳定的保护机制，另外还是基因表达调控的一条重要途径。小干涉RNA(small inter?fering RNA，siRNA)是指干涉RNAi过程中在细胞内产生的长约21～23核苷酸(nt)的小双链RNA分子，是RNAi发挥功能的重要中间效能分子。RNAi自从1998年发现以来，就以其独特的优势在功能基因组学研究中迅速占有一席之地，迄今已成为基因研究中不可或缺的工具之一，并且随着对其作用机制的逐步了解和应用技术的日渐成熟，已开始应用于疾病防治等多个方面。本文就其机制，主要特征，以及在消化系肿瘤中的研究作一简单综述。

1 作用机制及主要特征

1.1 作用机制

RNAi在哺乳动物细胞中有两种作用机制：一种是大于30 nt的长双链RNA(dsRNA)产生的广泛的、非特异性效应。其机制可能是激活了细胞内的蛋白激酶R和RNA酶L，从而导致了非特异性的细胞凋亡。另一种是21～23 nt的短双链RNA(siRNA)产生的相对具体的、特异性效应。目前，RNAi在抗病毒及肿瘤中的研究主要集中在siRNA产生的特异性效应，故下面主要介绍siRNA的作用机制。

siRNA的作用机制目前尚未完全阐明，但已基本达成共识，即①dsRNA在细胞内与DICER酶(一种RNAaseIII家族中特异性识别dsRNA的酶)结合，随即被分割成21～23个核苷酸的短链dsRNA，在这个过程中需要ATP的参与。②分割下来的短链dsRNA即为siRNA，它是RNAi的起始诱导物，与DICER酶形成RNA引导的沉默复合体(RISC)，此时RISC无活性，随后，siRNA经历一个依赖ATP的解双链过程激活RISC[2]。③siRNA特异性地识别靶基因转录的mRNA，并引导RISC结合mRNA，RISC中的DICER酶将mRNA切割成21～23个核苷酸片段，此后mRNA被逐步降解，导致不能进行翻译过程，从而引起目的基因沉默，抑制靶基因的表达。④新产生的dsRNA(siRNA)可继续形成RISC复合物进入新一轮RNAi的循环，产生正反馈效应。这一过程需在RNA依赖RNA聚合酶(RdRP)的条件下进行。除上述机制外，转基因真核生物dsRNA 还可引起相应基因的甲基化，促使异常RNA产生，最终导致基因沉默[3,4]。

1.2 主要特征

1.2.1 高度特异性 RNAi严格遵循碱基配对原则，只降解与之同源的基因的RNA，达到阻止基因表达的目的。

1.2.2 高效性 相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达，在哺乳动物中虽没发现扩增效应，但在细胞实验中只需摩尔级浓度的 siRNA 即可有效抑制目标基因的表达。

1.2.3 可传递性和可遗传性 RNAi抑制基因表达的效应可跨越细胞的界限，甚至可以传播至整个有机体及子代细胞。

1.2.4 浓度、时间双重依赖性 在一定时间内RNAi的效应强度随siRNA的浓度增高而增强，或浓度一定的情况下，随着时间延长，siRNA在细胞内发生正反馈效应，导致浓度增高，使RNAi效应增强。

1.2.5 ATP依赖性 目前研究发现RNAi中至少有2个步骤消耗ATP[5]：DICER酶切割dsRNA成为siRNA并使其5′端磷酸化或胞内磷酸化酶使导入的siRNA 5′端磷酸化而使其成为有活性的siRNA的过程RISC活化即siRNA解双链的过程。

2 RNAi在消化系肿瘤治疗中的应用

肿瘤的发生、发展与原癌基因的激活，抑癌基因的失活，以及凋亡相关基因的异常表达等均有密切的关系。因此我们可以针对这些因素，利用RNAi相关技术在不影响正常基因功能的条件下抑制突变基因表达或基因的表达过量，从而达到基因治疗的目的。另外，肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，当单一癌基因的阻断不能完全抑制或逆转时，可以设计一种针对同一家族多个基因的保守序列的siRNA分子，便可以同时抑制这一家族的多个基因表达，且抑制效果互不干扰。

2.1 原癌基因

原癌基因是细胞基因组内正常的组成成分，自然状态下无致癌作用，其主要作用是通过编码生长因子等调节正常细胞的生长、分化。原癌基因激活是肿瘤发生的根本原因之一，因此，如何抑制原癌基因的激活成为目前研究肿瘤治疗的热点之一。

2.1.1 Ras基因 Ras基因是目前已知的在人类肿瘤中呈活化状态最普遍的原癌基因，有数据显示此基因的突变现象存在于30%～50%的肿瘤组织中，在胰腺癌中可高达85%。Brummelkamp等[6]建立了突变体的表达系统即pSUPER?K?rasv12，转染人胰腺癌CAPAN?1细胞系后，观察到pSUPER?K?rasv12能显著降低K?rasv12的mRNA表达水平。构建突变体K?rasv12的siRNA病毒载体转染CAPAN?1细胞亦能抑制细胞克隆生长，并阻止裸鼠肿瘤的形成而对照组细胞生长良好并产生克隆，体内裸鼠实验5周内均长出肿瘤，因此证明了该siRNA具有明显的特异性和抑制肿瘤生长的作用。 同时，他们采用反转录病毒载体RNA系统在体外也成功地抑制了ras基因的表达。

2.1.2 Fos基因 Fos基因是一个重要的促进肿瘤细胞转移的基因，其产物Fos蛋白与肿瘤细胞的运动有关。Fra?1蛋白是Fos蛋白家族的成员之一，主要在大肠癌Hct?116细胞株和BE细胞株中表达。用siRNA 转染fosL基因，然后再转染到BE细胞中，发现Fra?1蛋白对细胞的增殖没什么影响，却极大地降低了BE细胞的运动能力，大约降低为原来的1/10[7]。

2.2 抑癌基因

由于抑癌基因在细胞增殖调控中起重要作用，因此也成为基因治疗的重要目标之一。p53基因是最早利用RNAi技术研究的基因之一，人体内大约50%肿瘤的发生是p53基因突变的结果。p53基因能够抑制DNA合成及诱导DNA修复来抑制细胞生长，使细胞停滞在G1期。突变型p53失去对细胞增殖的负调控作用，导致细胞增殖失控发生癌变。Martinez等[8]的报道中，将H1299细胞转染野生型p53和突变型p53的RNA表达型质粒，结果，野生型siRNA明显抑制野生型p53蛋白的表达，对突变型几乎无效而突变型siRNA显著抑制突变型p53蛋白表达，野生型基因则不受影响。由此证明，RNA序列能特异性地分别抑制这两个基因的表达，并且对突变型p53的抑制可在一定程度上恢复野生型基因的表达和功能。这就为选择性和个体化治疗肿瘤提供了可能。

2.3 细胞凋亡相关基因

细胞增殖和凋亡之间的动态平衡对于机体的生长发育有着举足轻重的影响。凋亡过程的失调可能导致肿瘤的发生。有研究表明[9]，将表达有绿色荧光蛋白(GFP)的Bcl?XLsiRNA转染人胃癌细胞株MGC?803，用RT?PCR和免疫荧光法检测Bcl?XL的表达，48 h后发现，与siRNA阴性组相比，实验组GFP明显减少，Bcl?XL蛋白和Bcl?XL mRNA表达减少到基准水平以下，并有自发的细胞凋亡现象，凋亡率达21.17%。这就说明Bcl?XL特异性siRNA能够抑制凋亡抑制基因Bcl?XL的表达，从而诱导胃癌细胞株MGC?803凋亡。

2.4 其他相关基因

2.4.1 Her2基因 Her2基因在胃癌等肿瘤的发病中起到重要作用，尤其见于弥散型胃癌。有研究表明将核仁蛋白NoL8特异性siRNA转染3种弥漫型胃癌细胞ST?4，MKN45，TMK?1，可以有效地降低该基因的表达，并能诱导这些细胞发生凋亡。因此，可以考虑把Her2作为胃癌基因治疗的又一新的靶点[10]。

2.4.2 β?连环蛋白和APC基因 β?连环蛋白和APC基因是WNT信号传导途径的关键成分。这些基因的突变可引起β?连环蛋白表达水平增加，导致细胞过度增生，促进结肠息肉和结肠癌的发生。Verma等[11]构建了β?连环蛋白的多个靶区域，使得蛋白表达量降低90%。有学者进一步用转染β?连环蛋白siRNA 的结肠癌HCT116细胞注射裸鼠，发现有50%的老鼠存活超过70 d，而对照组则全部死亡。

2.4.3 血管内皮细胞生长因子(VEGF) VEGF是体内一种重要的促血管生成因子，在恶性肿瘤的发生、发展及预后过程中均有着极其重要的作用。Zhang等[12]设计了针对鼠VEGF各亚型的siRNA，以DNA为模板在细胞内诱导小片段双链RNA的形成，干扰结果均特异性抑制相应VEGF的表达。同时，Takei等[13]设计了针对人VEGF的siRNA，采用体外合成法得到相应的siRNA，将其注入到荷瘤鼠模型的肿块中。结果肿瘤组织中的VEGF在mRNA水平和蛋白水平的含量明显低于对照组，肿瘤体积亦明显小于对照组。徐文华等[14]设计两组针对VEGF?mRNA 的siRNA,用脂质体转染人胃腺癌细胞系SGC?7901,观察其细胞周期的变化。发现G0/G1期细胞增多, S期细胞减少,细胞周期阻滞于G0/G1期并能诱导细胞凋亡产生凋亡小体。这些结果无疑将给肿瘤的基因治疗提供了新的思考方向。

2.4.4 TGF?β1 TGF?β1是一种多功能生长调节因子，与多种肿瘤的转移关系密切。它可使胃癌细胞表达的黏附分子如CD44表达增多抑制腹腔内淋巴细胞活性使其无法有效杀伤腹腔内游离癌细胞以及血管生成，同时可使间皮细胞变形，腹膜纤维化等。吴涛等[15]利用载体介导的RNAi技术干扰TGF?β1，发现TGF?β1蛋白在人胃癌细胞株SGC?7901中下降约65.8%，腹膜间皮细胞TGF?β1蛋白下降约61.8%。这一结果有力证明了siRNA能抑制TFB?β1在人胃癌细胞株SGC?7901和腹膜间皮细胞中的表达，为今后胃癌腹膜转移靶向治疗奠定了坚实的基础。

2.4.5 埃兹蛋白(Ezrin) Ezrin作为ERM (ezrin radixin moesin)蛋白家族的成员,是一种细胞膜与细胞骨架的连接蛋白，其主要功能是参与细胞的生长和信号转导,接受胞外信号,使骨架蛋白重新排布,并增加细胞运动能力。近来发现, Ezrin的表达与大多数肿瘤转移相关,如Ezrin表达水平与黑素瘤的分级[16]和乳腺癌的发生转移[17]均呈正相关。颜歌等[18]采用小干扰RNA 方法抑制肠癌细胞系Lovo和SW480中的Ezrin的表达,发现Ezrin mRNA和蛋白表达水平均显著下调，肿瘤细胞的运动侵袭能力下降,穿过人工基底膜的细胞数量明显减少。这预示Ezrin蛋白有可能成为抑制肠癌发展、转移的新靶点。

2.4.6 多药耐药(multidrugresistance，MDR) MDR一直是肿瘤治疗的棘手问题之一。研究证实抑癌基因Runx3的缺失和胃癌MDR相关, Guo等[19]应用siRNA敲除Runx3基因后发现癌细胞对多种化疗药物耐药,将携带Runx3的真核生物表达载体转染人类胃癌耐药细胞系SGC7901,体外药敏性分析显示SGC?7901 对各种化疗药物敏感。进一步分析显示Runx3可以抑制MDR?1和MDR相关蛋白1 (MRP?1)启动子的活性, Runx3的高表达可能通过下调MDR?1，MRP?1，Bcl?2的表达,进而使胃癌细胞对化疗敏感。另外，其中的MDR1基因的过度表达及其基因产物P糖蛋白增加是导致MDR的重要原因之一，Nieth等[20]设计了特异的siRNA分别处理胰腺癌EPG85?257RDB细胞和胃癌EPG85?181RDB细胞来抑制MDR1的表达。结果发现这两种细胞的MDR1的mRNA和蛋白表达量可降低90%以上，癌细胞对柔红霉素的耐药作用分别降低了89%和58%。这也提示我们，siRNA介导RNAi技术为克服肿瘤耐药问题可能提供新的策略。

2.4.7 保罗样激酶1(Polo?like kinase 1, Plk1) Plk1是丝氨酸-苏氨酸激酶之一，参与了有丝分裂的不同阶段。Jang等[21]检测发现280例胃癌患者中Plk1表达率高达95%(268/280)，用RNAi的方法阻断Plk1表达后，癌细胞的生长明显受抑。用siRNA敲除Plk1基因后，细胞周期调节蛋白B的表达增加，胃癌细胞堆积于G2/M期，有丝分裂纺锤体形态异常，染色体分离延迟，胞质分裂延迟或者停止，增殖减慢[22,23]。另外，Plk1基因的缺失亦伴随癌细胞凋亡的增加，提示Plk1可能成为胃癌基因治疗的理想靶点。

3 问题与展望

RNAi这一方兴未艾的新技术，为肿瘤及其他疾病的基因治疗提供了新的途径。但是仍有许多问题亟待解决：①如何在体内实现靶基因RNA转移到所有肿瘤细胞并稳定持久地抑制癌基因表达②如何确定21～23 nt左右的核甘酸序列作为siRNA模板的选择原则③如何提高载体系统的效率等等。总之，RNAi技术作为一种研究的新工具，治疗的新手段，随着对其机制的不断认识和技术的改进，必将在消化系肿瘤的研究及治疗中担任不可替代的角色，同时也预示着后基因组时代里一个崭新的RNA时代的到来。

【参考文献】

[1] Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double?stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature, 1998,391(6669): 806-811.

[2] Schwarz DS,Hutvagner G,Haley B,et al.Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways[J].Mol Cell, 2002, 10(3): 537-548.

[3] Hannon GJ.RNA interference[J].Nature,2002,418(6894):244-251.

[4] Cerutti H.RNA interference：traveling in the cell and gaining functions?[J].Trends Genet,2003,19(1):39-46.

[5] Nykanen A,Haley B,Zamore PD.ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway[J].Cell,2001,107(3):309-321.

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李慧云 女，汉族，1938月9月生于滦县城内北街。1960年毕业于石家庄市师范大学化学系本科。后在华北煤炭医学院任生物化学教师。1978年定居香港，就职于香港中文大学中药研究中心和医学院生物化学系，任助理研究员。1990年任香港土力混凝土工程有限公司化学实验室主任、化学师。

田广善 男，汉族，原籍滦县刘庄户。1948年毕业于河北农学院农艺系。同年赴台湾，执教于台湾省立桃园市高级中学，任生物学、地球科学教师，并任高一年级导师。执教期间数度进入各高等学府深造。1988年获资深优良教师奖章。

吴守明 男，汉族，1938年5月出生于滦县王庄子村，1961年7月毕业于天津河北美术学院，任河北美术出版社编审，中国美术家协会会员，中国书法家协会会员，河北省美术家协会理事，河北省山水画研究会会长，河北省篆刻研究会副会长。1984年后任河北美术出版社画册编辑室主任。著有《山水画变革要述》和《山水画构图》。1995年分别被英国剑桥国际名人传记中心和美国国际名人传记协会聘为终身顾问。1995年被国务院批准为享受政府特殊待遇津贴的专家。

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赵 光 女，1916年11月生于滦县高各庄村。曾用名康贵真，康贵儒，赵光程。1933年参加革命，1934年10月加入中国共产党，1938年6月参加冀东人民抗日大暴动。曾任丰滦迁卢联合县区委书记，滦南县公安局局长、唐山市公安局人事科科长、唐山市委直属机关党委副书记、唐山市政协副主席。

王俊茹 女，1956年8月生于滦县老城四街，1976年考入河北医学院，1982年在第三军医大攻读硕士学位，1988年攻读博士学位，副主任医师。研究课题及撰写论文多次在全国会议上交流，并多次获奖。1994年4月到美国爱奥瓦大学主要进行分子生物学内脏肿瘤的研究，现为美国阿肯色州大学教授，主持利用分子生物学的方法进行肿瘤研究。

汪思涛 男，1959年1月生于滦南县，后移居滦县，1977年考入华北农业大学（北京农业大学前身），后攻读硕士学位、博士学位，主要从事农业微生物研究。1987年任北京农业大学副教授，博士生导师。1995年6月出国到墨西哥城留学攻读博士后，现为墨西哥城国立大学教授，主持农业微生物研究。

刘兆祥 生于1906年的评剧老艺人刘兆祥，原籍河北滦县，出身于艺人家庭，15岁时随父亲到东北营口坐科学习评剧，既能演小生、老生，又能演小丑、花脸，演唱功底扎实，技艺全面，文武皆擅。他在《珍珠衫》中扮演的老生吴杰、在《斩经堂》中扮演的武老生吴汉、在《桃花庵》中扮演的小生张才、在《杨三姐告状》中扮演的拐子高贵合等，都具有鲜明的人物个性，十分拿手。早年曾傍著名评剧女演员李金顺、李银顺、碧莲花、白玉霜等演出，后来又长期与新凤霞、鲜灵霞合作。1931年“九·一八”事变后自冀东来到天津，从此就与这块文化积淀深厚的沃土结下不解之缘。

由于刘兆祥戏路子宽广，能演善唱，会戏甚多，被同行公认是评剧“百科全书”。他先后收过鲜灵霞、翁艳楼、王月仙、金彩云等多名弟子，其中鲜灵霞成功走上评剧舞台，成为一代红伶，就得益于恩师刘兆祥的精心栽培。

鲜灵霞是在15岁时跟随刘兆祥学戏的。刘兆祥按照她的天赋条件，为她传授了刚劲动听、高昂挺拔、顿挫有力的李（金顺）派唱腔，第一出戏就传授给她以唱工著称的青衣戏《井台会》。鲜灵霞以此剧亮相评剧舞台，并一炮打红。在鲜灵霞学戏期间，刘兆祥为了增加她嗓子的耐力，每天都给她规定半天时间吊嗓子，清晨还亲自带她到墙子河畔喊嗓子练声，为鲜灵霞奠定了坚实演唱基础。鲜灵霞生前经常念及师傅对她的严格训练，始终不忘师恩。

刘兆祥为人朴实谦和，生活作风严肃正派，一生烟酒不沾，无任何不良习气。由于亲身经历过旧社会艺人所遭受的种种磨难与凌辱，所以热爱新社会，对党有着深厚情感，1960年就加入了中国共产党，在评剧老艺人中起到表率作用。他在演戏授徒之余，还刻苦钻研写作，以他在乡村仅读过的五年私塾为基础，勤奋练习编写剧本，先后创作、改编了《海棠红》、《姊妹花》、《玉面狼》、《棠棣之花》、《玉虎坠》等剧目，其中表现评剧艺人在旧社会惨遭凌辱的时装戏《海棠红》，曾被关里关外多家剧团上演，反响颇大。尤其是在解放以后，为配合党的中心工作，如普及新婚姻法、取缔反动会道门、治理海河、宣传抗美援朝、庆祝西藏和平解放、开展爱国卫生运动等，他都及时编写一些短剧，或在戏前加演，或深入街道里巷为居民演出，起到了一定的宣传教育作用。1960年，他从天津戏校教师岗位退休以后，义务参加街道工作，一直担任多年红桥区西门外三道街居委会主任、党支部书记等职务，认真贯彻党的方针政策，关心居民生活，热心为群众服务，始终不取任何报酬，多次被区街评为优秀党员、先进工作者、模范军属等光荣称号，在当地居民中有口皆碑。

1995年初，老人病危住进黄河道医院，弥留之际，他把儿女们叫到床前，向他们交代“后事”，没有一句家长里短，而是嘱咐家人不要忘记党的恩情，要永远听党的话，一辈子不做任何对党不忠诚的事情。听了老人临终前这番意味深长的嘱托，家人们不仅深受激励，同室病友也都非常感动，一位住院的企业干部感慨地说：“这是一位真正的革命老人，了不起啊！”

用途 : 以观赏为主，属于观赏植物。树干可作手杖、伞柄、屋柱，嫩芽可食。

种子，抗癌。用于食道癌、肺癌，绒毛膜上皮癌，恶性葡萄胎，白血病。

行道树、风景树通过乙醇浸提、减压蒸馏滤液后得到蒲葵籽乙醇提取物，分别采用气相色谱-质谱联用技术及MTT法对提取物的化学组成及其抗癌活性进行了分析。

气相色谱-质谱分析共分离出39个峰并鉴定出其中的21种化合物，结果表明该提取物的主要成分为亚油酸、棕榈酸甲酯、月桂酸乙酯、亚油酸乙酯及植物甾醇等。

抗癌活性分析表明，蒲葵籽乙醇提取物对宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、人肝癌细胞株Bel7402等三种癌细胞均有一定的抑制作用，具有一定的抗癌活性。

扩展资料：

葵扇子是一款喜湿喜暖的植物，如果温度过低容易对它的生命造成危害，所以一般将其种植在温度高于-1摄氏度的南方环境中最为适合。平常多给予光照就能使其正常生长。

蒲葵虽然喜光照但是不能暴晒，尤其是光照强度厉害的夏季应适当对其进行遮阴处理。

炎热的夏季无论是人还是植物对于水的需求都是非常大的，对于蒲葵来说也是如此，故而在炎热的夏季需要多浇水，同时对其叶片喷洒水分，使得周围空气湿度提高，更好地保证其叶片正常生长。夏季多浇水，那么冬季是否要少浇水呢？是的，冬季天气比较寒冷，水分不易流失，故而需要控制浇水。

参考资料来源：百度百科-葵扇子

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