目前主要有三种方法测定端粒的长度:
1、Southern blot,目前该方法被认为是金标准方法,系将提取到的待测基因组DNA首先用限制性内切酶HinfⅠ消化,再用琼脂糖凝胶电泳分离,转移至尼龙膜上后与放射性同位素P32标记的(CCCATT)N探针杂交,放射自显影显示端粒DNA片段位置,测其光密度进行半定量检测。该技术所测得的端粒序列还包含了亚端粒区序列,不能提供端粒的实际长度,也不能对端粒长度进行精确的定量。同时该技术耗时耗力,且需要大量的DNA。
2、flow-FISH,它综合了流式细胞仪和荧光原位杂交,但技术复杂,存在细胞固定与染色体DNA完全变性的固有矛盾,且杂交探针进入细胞的数量与未杂交探针洗出细胞的完全性均无法控制,且需要在整个实验流程中保持细胞完整才能分析,而且定量不够准确。
3、定量PCR,即设计合成端粒DNA序列特异的引物对端粒DNA进行荧光定量PCR扩增,同时用单个参考基因来标准化端粒分析的Ct值,每个样品的端粒长度表示为相对的端粒与单拷贝基因的比值(T/S比值)。端粒长度,该方法虽然灵敏度高,但由于端粒DNA序列为近上千拷贝的6核苷酸重复序列,扩增过程中出现的产物极其复杂,且重复序列本身就难以有效扩增,因此定量结果难以令人信服,也缺乏标准化。
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