冰冻切片的制作步骤及每个步骤的要求和作用？_备孕

冷冻切片 1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（1~3分种）。 2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5~10μm间。 4、调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，以切出完整、平滑的切片为准。切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带，可避免组织摊片过程中皱折，保证组织结构的完整及切片的美观。注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织，普通胶水或 OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。（OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。） ②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻，约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上，组织周围再加一些胶，再次置于冷冻机中冷冻，这样组织被垫高，就能快速切出高质量的切片。 ③冷冻箱及冷冻头的温度高低，要根据不同的组织而定。温度过低会导致组织块过硬，切片碎裂，出现梯田状薄厚不均或空洞；反之，温度过高，组织块硬度不够，切片不易成形或成皱褶。数据图1供参考。 ④当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。 ⑤用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。四、常用冰冻切片苏木精—伊红染色染色步骤：1、冰冻切片用10%甲醛固定1~5分钟，流水冲洗2分钟，蒸馏水浸洗3分钟。 2、苏木精1~2分钟。自来水快洗。 3、0。5%盐酸乙醇分色1~2秒。蒸馏水快洗。 4、0。25%~0。5%氨水蓝化，几秒种或至组织变蓝，自来水洗30秒~1分钟。光镜下检查细胞核分色程度。 5、1%伊红1分钟。蒸馏水快洗。 6、80%、90%、95%乙醇速洗，每级数秒到十几秒。光镜下监控细胞核与细胞质量颜色对比。 7、100%乙醇2次，每次1~2分钟。 8、二甲苯2次，每次1~2分钟。中性树胶封固。注：①结束阶段的二甲苯作用为透明，其目的是增强标本的折光率，达到光镜下清晰观察染色结果。标本内若含水分可降低其折光率，导致光镜观察细微结构不清楚的结果。另二甲苯透明后有得于组织细胞的长久保存。 ②HE染色的水洗：整个染色过程中共5处涉及到水洗，但其洗涤程度及作用均有所不同。苏木精染色前的水洗为蒸馏水浸洗：切忌自来水替代蒸馏水浸洗，否则苏木精染液由弱酸性（棕红色）转变为弱碱性（蓝色），导致“有色沉淀”出现与积累，致使染色结果为黑蓝色。苏木精染色后的水洗为自来水洗，伊红染色后的水洗为蒸馏水快洗，作用是洗去未与组织相结合的染料成分，即洗去“浮色”。伊红染液为水溶性溶液，浸洗时间长会使组织的伊红颜色减退。分色后的水洗为自来水快洗，目的是终止分色液（0。5%盐酸乙醇）对组织细胞的分色作用。过度分色将致使染色强度减弱，影响苏木精与伊红颜色的匹配。蓝化后的水洗为自来水冲洗，洗掉组织中多余的碱性成分（淡氨水），为伊红染色提供适宜的染色环境。五、冰冻切片的快速染色法 ① 切片固定30秒-1分钟。 ② 水洗（10秒）。 ③ 染苏木素3-5分钟。自来水冲洗片刻。（在组织上加苏木精染液数滴，放在漂片机上的烤板上加热一分钟。染液不能干） ④分化（1%酸乙醇分化）。 ⑤ 于碱水（氨水）中返蓝20秒。 ⑥ 伊红染色10-20秒。 ⑦脱水，透明，中性树胶封固。注：固定液的选择 A中性福尔马林溶液 B 95%乙醇 C AF(40%福尔马林10ml,95%乙醇90ml) D Carnoy（纯乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml） E Clzrke改良液[4]（纯乙醇95ml，冰醋酸5ml） F Bouin液（饱和苦味酸水溶液75ml，甲醛水溶液 25ml，冰醋酸5ml） 6种固定液固定后的组织切片染色效果各有差异，其中C 固定液固定的切片染色效果最好，组织结构清晰，核染色鲜艳，核无明显肿胀，核浆对比度好，镜下与石蜡切片相似（图1）。 D 液、E 液、F 液染色效果均较好，结构较清晰，核染色较鲜艳，但核有肿胀，核轮廓有些模糊。A 液染色效果较差，组织结构尚清楚，但细胞核肿胀比较明显且境界模糊不清（图2）。B 液染色效果差，核着色不良，结构模糊。甲醛、乙醇、冰醋酸

冰冻切片焦油紫染色法的实验方法原理：冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。

实验材料：新鲜组织

试剂、试剂盒：H2O2酒精丙酮PBSDAPI工作液中性树上

仪器、耗材：OCT速冻架恒冷箱切片机烘箱荧光显微镜

实验步骤：

一取材

应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。

二速冻

1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。

2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。

3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

4、在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。

5、若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。