大脑中的CD19表达与CAR-T治疗关系

注：mural细胞，翻译成“壁细胞”，但与本视频中“B细胞”

发音相近，特此用mural细胞，以示与“B细胞”的区别

作者首先分析了2364个人前额叶皮层来的单细胞RNA测序数据，把这些数据做了聚类

在聚类后的数据中，排除掉了神经性的细胞、神经前体细胞、和红细胞

剩下的细胞簇，再做UMAP图，分成星型细胞、淋巴细胞、微胶质细胞、少突胶质细胞、周细胞和内皮细胞

区分这些细胞，都是通过一系列经典的marker基因的表达来做的

作者惊奇地发现，有一小部分细胞，这些细胞同时表达CD19，和mural细胞的marker基因CD248

但这些细胞不表达B细胞的marker基因CD79A

这说明，在大脑里，是有表达CD19基因的细胞的。而且这些细胞不表达B细胞的marker基因CD79A

说明这些细胞既不是B细胞，也不是混合有B细胞的双细胞。

作者进一步观察到这些细胞还表达CD81基因，而CD81蛋白是CD19的伴侣蛋白

CD19本身是一个跨细胞膜的蛋白，它需要CD81蛋白的帮助，来完成跨膜动作

作者还在细胞簇的表达中，看到了淋巴细胞簇，淋巴细胞簇表达CD3、CD7、IL2RG等marker基因

而周细胞表达的基因，与淋巴细胞簇表达的基因，是互斥的

这个进一步说明了，在大脑中表达CD19的细胞，不是淋巴细胞，而是周细胞

这是对周细胞中CD19表达水平的分析

CD19基因的表达量，在周细胞的所有基因的表达量中排序，排到前86%的位置

同时，可以看到周细胞中其它几个marker基因的表达水平，CD248是前85%，RGS5是前96%，

PDFGFRB是前97%

也就是说，在周细胞中，CD19的表达水平是较高的

作者找了更多的数据集来进行分析

在一个人类前脑的数据集中，mural细胞是表达CD19的，但不表达CD79A

作者在第三个数据集中，进一步做分析，

在周细胞中，有较多细胞是表达CD19的，但这些细胞不表达B细胞的marker基因CD79A

在内皮细胞中，有少量细胞是表达CD19的，但这些内皮细胞都不表达CD79A

在La Manno的两个数据集中，周细胞中的CD19表达量，分别是所有基因排名的前86%，和前71%

这也说明CD19在mural细胞中、周细胞中的表达水平是较高的

为了评估在人脑mural细胞中的CD19的表达，作者做了免疫组化。

样本来自健康死亡的人，我估计是死于车祸之类的人的大脑

用的抗体的编号是BT51E。这个抗体是识别CD19蛋白的C末端的，C末端是位于细胞质这一面的

免疫组化的结果可以看图，图中在：海马、岛突、颞叶、脑桥、额叶、枕叶、顶叶等位置，都发现了有染色

也就是图中用黑色箭头标的这些位置

也就是说在大脑的各个位置都有CD19的表达

为进一步分析大脑在各个发育时期的CD19的表达，

作者找到了BICCN的数据集

BICCN数据集是BRAIN initiative Cell Census Network的缩写

作者找了来自101个样本85万7千个细胞的数据，这些样本都是不同发育时期的胚胎人类大脑

作者把这85万个细胞的数据做了整合，整合出了885个元细胞

接着，对这些元细胞做聚类分析，得到UMAP图

这张UMAP图是按元细胞的胎龄来标的颜色，颜色越深，胎龄越大

这是按转录组相似性分出来的细胞簇，不同的簇用不同的颜色进行标示

在元细胞中，我们可以清楚地看到，有CD19的表达。

同时，我们可以看到，这些元细胞中，有未分化的祖细胞marker基因PAX3的表达

和周细胞的几个marker基因的平均表达水平

可以看到在mural元细胞簇中，周细胞marker基因特异性高表达

也就是CD248这些基因在第6号的元细胞簇中特异性地高表达

在这张图中，横座标是周细胞marker基因的表达水平，纵座标是CD19基因的表达水平

我们看到，CD19基因的表达水平，和周细胞marker基因的表达水平，有强相关性

作者还发现，在小胶质细胞簇中，CD19低表达

这三张图，分别是三类基因在胚胎各个阶段的表达情况

从上到下，胚胎的胎龄越来越大，

每个小柱子的高度，表示有多少个元细胞表达这个标志基因

可以看到，胎龄15周之前，没有观察到CD19的表达

并且，在这些细胞中， 没有观察到B细胞的marker基因的表达。

这是marker基因表达的热图。

图中分成两块，左边这块，是属于神经血管的元细胞

右边这块，是神经血管之外的元细胞，

我们可以看到，神经血管的元细胞的marker基因表达，

与非神经血管的元细胞的marker基因表达，差异很大

这让作者可以清楚地把两群元细胞给分开。

而且，我们可以看到CD19在神经血管的细胞中，有高表达

在别的细胞中，CD19的表达量很低

进一步的数据分析，可以看到，CD19不仅在周细胞中表达，还在内皮细胞中有表达

接着，作者把非神经元的细胞亚群，做成UMAP图，

并且把这些细胞分别按细胞簇、时间、空间，做了区分

接着，作者做了各种细胞对应marker基因的表达

可以看到CD19的表达，与血管平滑肌细胞、周细胞、皮细胞，是有交集的

这是从发育的时间轴上看各marker基因的表达。

横轴是发育的时间轴，可以看到，15周胎龄之前CD19的表达很少，20周之后，有CD19的表达

为了看不同年龄的人的大脑中CD19基因的表达，

作者找了500个人类大脑不同时期、不同大脑部位的样本进行分析

图中蓝色的点是出生之前的大脑样本中CD19基因的表达情况，

棕色的点是出生之后，一直到40岁，大脑样本中的CD19基因的表达情况。

我们可以看到自始至终，大脑一直都有CD19的表达。

同样，我们可以看到，CD248这个mural细胞的marker基因，也自始致终有表达

令作者吃惊的是，CD248, CSPG4, ANPEP, FOXS1, 和FN1这些基因的表达

与CD19的表达的相关性，排在前1%

作者对与CD19表达相关性最高的200个基因做GO富集，

发现富集的条目是与神经血管单元、血管生长、对流体切变力的响应、和多种细胞外间质

这些条目是相关的

这提示，CD19在成年人大脑中的表达，与mural细胞的丰富程度有关，而与B细胞不太有关系

看各种细胞中含CD19和marker基因的含量

CD19和CSPG4在周细胞与内皮细胞中表达较高。

B细胞中富集的CD22和CD74，在周细胞与内皮细胞中表达较少

临床上使用的针对CD19的CAR-T是针对CD19的第4个外显子的。

另外，跳过第2个外显子的CD19的突变蛋白，会缺乏向细胞表面的转运，

因此，作者分析了大脑中表达的CD19的各个外显子的表达水平

图中，从左到右分成15段，每一段就是一段CD19的外显子。

可以看到，各个外显子的表达均匀分布，包括外显子2和外显子4，都是均匀分布的

作者为了了解小鼠mural细胞中是否有CD19的表达，进行了研究。

从健康的C57BL/6J小鼠中提取并分离了全脑。

并通过流式细胞仪的分析，证明了有表达CD19的细胞存在，尽管表达CD19的细胞的数量较少。

相比于人类大脑中的CD19的表达水平，小鼠大脑中的CD19的表达水平相对较低

作者针对小鼠和人类的CD19分别做CAR-T细胞。

一共做了三种CAR-T细胞

CAR-T细胞的CAR分子设计中有两个关注点

1、左边针对的目标分子有两种，一种是针对小鼠的CD19，另一种是针对人类的CD19

小鼠的就用字母m开头，人类的就用字母h开头

2、第三段基因片段，有两种选择，分别是4-1BB和CD28

这样，就有了三种CAR分子

然后，作者对两种培养细胞，用三种CAR-T做了CAR-T的裂解实验。

被裂解的两种培养细胞，分别是人类的、和小鼠的。

左边的这是Nalm6细胞，是培养的人类细胞。

我们可以看到，是红线的裂解率最高

也就是针对人类CD19的CAR-T对Nalm6这种人类的细胞的杀伤力最强

右边的这是A20细胞，是培养的小鼠细胞

我们可以看到，是绿线的裂解率最高

也就是针对小鼠的CD19，并且用CD28作为CAR分子第三段的这种CAR-T，它的裂解率最高

接着，作者对特殊的NSG小鼠做CAR-T处理。

这种NSG小鼠的特点是它是免疫缺陷的，它没有B细胞。

之所以选用这种小鼠

是因为本项研究，就是看针对CD19的CAR-T治疗对B细胞之外的细胞、器官造成的伤害

那么NSG小鼠没有B细胞，实验过程中就可以排除因为CAR-T进攻B细胞造成的伤害

所观察到的伤害，都排除了B细胞的影响

我们看图，图中是NSG小鼠在经过CAR-T处理后，大脑的切片染色结果

蓝色是DAPI染色，是对细胞核的染色。

红色是EBD染色，体现的是血脑屏障的渗漏

图片分两排，上面一排是大图，下面一排是上面大图中那些小白框内的图形放大后的效果。

图片分5列

最左边的一列，是甘露醇（处理后的效果）

甘露醇是能够让血脑屏障的渗漏变高的一种化合物，在这里，相当于一个检测血脑屏障渗潳的阳性对照

第二列，没有加T细胞处理，也就是阴性对照

第三列到第五列，是3种CAR-T细胞的处理结果

可以明显地看到，第五列的图中，红颜色是较明显的

也就是说，针对小鼠CD19的用CD28做基因第三段的CAR-T

较大程度地增加了小鼠血脑屏障的渗透性

这是对刚才图像中EBD染色效果的荧光（强度）进行定量分析的结果

可以看到mCD1928z这个CAR-T处理，可以引起和甘露醇相近渗漏结果

另外，mCD19BBz这个CAR-T处理，也会引起一定的渗漏结果

这是作者用另一个“有免疫功能的”小鼠做血脑屏障渗漏实验的结果。

我们可以看到，在mCD1928z这个CAR-T处理的结果中，可以看到较强的红颜色荧光

作者还用核磁共振技术，来检查了小鼠经过CAR-T治疗之后，血脑屏障的渗漏

这张图中，脑子部分渗漏的情况越重的，颜色标得越偏红

可以看到，甘露醇处理的脑子，颜色最红

而余下的4个样本中，是用mCD1928z这个CAR-T处理后的脑子，颜色最红

最右边的图，是对核磁共振检测到的小鼠大脑的渗漏情况做一个定量的分析

图中显示，mCD1928z这个样本的渗漏，在各个实验样本中是最高的

这是作者把CAR-T处理后四天的小鼠脑组织解离后，用荧光流式细胞仪来做检测

看其中的表达CD19的细胞的数量

上面的图，是检测有CD45或CD41的细胞中，同时有CD19表达的细胞

下面的图，是检测有CD13的细胞中，同时有表达CD19的细胞

我们可以看到，针对人的CAR-T和针对小鼠的CAR-T分别处理之后

针对人的这组剩下的有CD19表达的细胞的比例，都高于针对鼠的这一组。

量化的计算的结果，也是这样的结论

也就是说针对鼠的CAR-T对表达鼠CD19的细胞杀灭功能是最强的

作者接着做了脑与肺的mural细胞表达分析

之所以要做肺的mural细胞表达，是因为肺当中的周细胞与内皮细胞特别多

作者想看这些细胞的基因表达与脑的mural细胞的表达有什么差异

以便为未来的CAR-T治疗找到方向

经过分析，作者发现CD19在大脑中特异表达，而在肺中几乎没有表达

而一些mural细胞的marker基因，如PDGFRB、RGS5、FOXS1和KCNJ8，在大脑和肺脏中都有表达

之前已经有科学家提出了用针对两种目标抗原的，

分别用“AND”或“NOT”方法来精选目标细胞的CAR-T治疗

所谓AND，就是要同时有对应到两种特定抗原的细胞，CAR-T才会启动杀灭功能

那NOT，就是有A目标抗原，但没有B目标抗原的细胞，CAR-T才会启动杀灭功能

那么现在有了精细的各种细胞的marker基因，也就为接下来的CAR-T研究提出了新的可行思路

CD19 CD20是B淋巴细胞表面抗原 自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生

建议检查一下有没有什么病毒感染,如巨细胞病毒、EB病毒、、弓形体等。CD19阳性细胞数升高最多见于各种病毒感染

尤其是慢性感染,应根据具体感染的病毒选择性应用抗病毒药物。B淋巴细胞数减少也主要是见于病毒感染,淋巴瘤化疗及美罗华治疗也会引起B淋巴细胞减少。祝早日康复。

---