ELISA实验步骤有哪些？

ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。

酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，出现颜色反应。

因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应基正，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

ELISA实验步骤及注意事项:

1、固相载体选择

聚苯乙烯：具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。

聚氯乙烯：聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。

2、包被

①板孔的选择：ELISA级别的微孔板。

②抗体选择：选择支持ELISA实验的抗体，根据推荐浓度稀释或摸索最适浓亮李度。

③包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液。

④包被温度：2-8 ℃过夜包被或室温（37℃）包被2h。

⑤包被浓度：包被浓度随载体和包被物的性质可有搏键悔很大的变化。一般包被浓度为10ug/ml-20ug/ml。

3、封闭

①包被之后一定要立即封闭（封闭非特异性抗体）。

②选择效果较好的封闭剂（细胞培养级BSA、Tween等）。

4、加样及孵育

①加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。

②孵育的时间及温度参考试剂盒说明书。如有条件，建议加样孵育时使用shaker震荡仪，推荐轨道直径3mm，转速在500±50rpm。

③检测抗体、酶标物的稀释比例、孵育温度、孵育时间严格根据说明书提示。

④洗板对于ELISA来说，是极其关键的一步，保证ELISA的特异性。

⑤封板膜一定要一次一换，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。

5、显色和终止

①使用前需检查，底物在加入96孔板之前应为无色透明。

②显色底物需现配现用，避免污染。

③孵育时间，说明书上为参考范围，具体需要根据实验条件自行摸索。可参考标曲浓度最大孔的颜色，变为蓝色较明显时即可。

1.　ELISA的原理

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记.结合在固相载体表面的抗原或抗体梁铅仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性.在测定时,受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开.再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上.此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例.加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析.由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度.

*** 作步骤:

1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条,未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条,密封口袋,放回4℃.

2．空白孔加标准品和标本稀释液,其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔),用封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱孵育90分钟.

3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液.

4．洗板5次.

5．空白孔加生物素化抗体稀释液,其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔).用新封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱孵育60分钟.

6．提前20分钟准备酶结橡档好合物工作液.避光室温(22-25 ) ℃ 放置.

7．洗板5次.

8．空白孔加酶结合物稀释液,其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔).用新封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱,避光孵育30分钟.

9．打开酶标仪电源,预热仪器,设置好检测程序.

10．洗板5次.

11．加入显色底物(TMB)100ul/孔,避光36℃孵箱,避光孵育15分钟.

12．加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测量OD450值(3分钟内).在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果.

13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存蠢陵至有效期结束.

建议保存酶标板框,以备下次或者今后试验使用.,10,检测原理: 本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上， *** 作步骤: 1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和,1,1.　ELISA的原理

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此...,1,

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