基因工程中如何获取目的基因

鸟q法 这种方法类似于鸟q发射散d。具体的做法是：用若干个合适的限制酶处理一个DNA分子，将它切成若干个DNA片段。这些片段的长度相当于或略大于一个基因。然后，将这些不同的DNA片段分别与适当的载体结合，形成重组DNA，再将它导入到相应的营养缺陷型细菌中。例如，当我们要提取维生素B1合成酶基因时，就要采用维生素B1的营养缺陷型细菌（它在不含维生素B1的培养基上不能生长）。把整合了不同DNA片段的营养缺陷型细菌分别接种到不含维生素B1的培养基上进行培养，只有那些整合了含有维生素B1合成酶基因的DNA片段的细菌才能正常生长。最后，把这些细菌中的这段DNA分离出来，再进行一系列的 *** 作，就可以获得维生素B1合成酶基因。这种方法的缺点是专一性较差，分离出来的有时并非一个基因，但由于这种方法 *** 作简便，所以现在仍然广泛采用。

反转录法 这种方法是在核糖体合成多肽的旺盛时期，首先把含有目的基因的mRNA的多聚核糖体提取出来，分离出mRNA，然后以mRNA为模板，用反转录酶合成一个互补的DNA，即cDNA单链，再以此单链为模板合成出互补链，就成为双链DNA分子。这种方法专一性强，但是 *** 作过程比较麻烦，特别是mRNA很不稳定、生存时间短，所以要求的技术条件较高。

氨基酸序列合成法 这种方法是建立在DNA序列分析基础上的。当把一个基因的核苷酸序列搞清楚后，可以按图纸先合成一个个含少量（10～15个）核苷酸的DNA片段，再利用碱基对互补的关系使它们形成双链片段，然后用连接酶把双链片段逐个按顺序连接起来，使双链逐渐加长，最后得到一个完整的基因。这种方法专一性最强，现在用计算机自动控制的DNA合成仪，进行基因合成，使基因合成的效率大大提高。但是这种方法目前仅限于合成核苷酸对较少的一些简单基因，而且必须事先把它们的核苷酸序列搞清楚。对于许多复杂的、目前尚不知道核苷酸序列的基因就不能用这种方法合成，只能用前两种方法或其他方法分离或合成。这种合成基因的方法还有一个很大的优点，就是可以人工合成自然界不存在的新基因，使生物产生新的性状以满足人类需求。因此，这一方法今后将随着技术的不断改进而得到越来越广泛的应用。

最近的推文将是一个大系列，目录就不放了，可能会有点多，主要涉及了基因注释，比较基因组学分析，基因家族分析等，大家看我博客的顺序就行。

基因注释参考链接 (不得不说州更大神真的是植物生信方面的专家了)

基因注释主要有三种策略

从头注释( de novo prediction)：通过已有的概率模型来预测基因结构，在预测剪切位点和UTR区准确性较低

同源预测(homology-based prediction)：有一些基因蛋白在相近物种间的保守型搞，所以可以使用已有的高质量近缘物种注释信息通过序列联配的方式确定外显子边界和剪切位点

基于转录组预测(transcriptome-based prediction)：通过物种的RNA-seq数据辅助注释，能够较为准确的确定剪切位点和外显子区域。

每一种方法都有自己的优缺点，所以最后需要用EvidenceModeler(EVM)和GLEAN工具进行整合，合并成完整的基因结构。基于可靠的基因结构，后续可才是功能注释，蛋白功能域注释，基因本体论注释，通路注释等。

在注释之前需要对重复序列进行屏蔽，可以参考我之前的推文： repeatmasker的安装与使用

可以看到在该文献中从头注释使用的是augustus和GlimmerHMM

AUGUSTUS的无root安装比较麻烦，我折腾了好几天最后卒，不过辛亏有bioconda， conda create -n annotation augustus=33

我这次预测的基因是一种担子菌，可以使用 augustus --species=help 查看已有的物种,在本次分析中，我使用laccaria_bicolor作为已有的模型(pudorinusmaskfa是去除重复序列的基因组序列)

如果嫌慢，可以试一下并行策略

GeneMark-ES/ET 则是唯一一款支持无监督训练模型，之后再识别真核基因组蛋白编码区的工具。

安装之后进行预测

最后得到的是genemarkgtf，是标准的GTF格式,可以使用gffread转换

从头注释已经完成，接下来的是同源与转录组。

faa = FASTA Amino Acid file 其内容是物种内所有基因对应的fasta格式的蛋白质序列信息

ffn = FASTA nucleotide coding regions file其内容是物种内所有基因的DNA序列信息，fasta格式

fna = FASTA Nucleic Acid file其内容是使用fasta格式表示的物种全序列DNA信息。

fa 是fasta的缩写

可以利用基因工程技术来分离目的基因,大致步骤是：1从供体中制备高纯度的染色体基因组DNA；2用合适的限制酶把DNA切割成若干个片段；3将这些片段分别与适当的载体分子进行体外连接；4重组载体导入受体细胞中或包装成噬菌体,适宜条件下培养；5观察培养基中的重组菌落或噬菌斑,筛选阳性克隆,再将其克隆中的目的基因提取分离出来即可

以上就是关于基因工程中如何获取目的基因全部的内容，包括:基因工程中如何获取目的基因、基因结构注释（1）：从头注释、.fa .fna和.fasta是同一种格式文件吗等相关内容解答，如果想了解更多相关内容，可以关注我们，你们的支持是我们更新的动力！