转基因的具体步骤，从目的基因的获得到最后的鉴定，谢谢

1:目的基因的获取。有三种方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增目的基因（3）人工合成

2：基因表达载体的构建。这个载体一般是质粒。

3：将目的基因导入受体细胞。这个导入植物细胞一般用农杆菌转化法，也可用基因q法或花粉管通道法。 导入动物细胞一般用显微注射法。 导入微生物细胞一般用感受态细胞吸收DNA分子的方法。

4：目的基因的检测与鉴定。这个分为4步：（1）用DNA分子杂交技术检测目的基因是否进入受体细胞（2）用分子杂交技术检测目的基因是否转录出RNA（3）用抗原抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出蛋白质（4）进行生物个体水平的鉴定（这步不是一定的，也可不进行）。进行生物个体水平的鉴定举个例子就是比如让虫子去啃食导入抗虫基因的植株，看是否抗虫。

书上给的：

基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,如何获得目的DNA片段就成为基因工程的关键问题。所需目的基因的来源,不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选

直接获取

1从基因文库中获取 这个没什么就是现成的基因储存在受体菌上你用的时候提取出来就好了（基因组文库法 就是原教材中的用限制性内切酶直接获取。利用λ噬菌体载体构建基因组文库的一般 *** 作程序如下：① 选用特定限制性内切酶， DNA进行部分酶解，得到DNA限制性片段② 选用适当的限制性内切酶酶解λ噬菌体载体DNA。③ 经适当处理，将基因组DNA限制性片段与λ噬菌体载体进行体外重组。④ 利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗粒。⑤ 以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑，从而形成含有整个DNA的重组DNA群体，即文库。）经典解释

2cDNA文库法（即原教材中提到的逆转录法）。cDNA文库，是指汇集以某生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体。虽然可用基因组文库法来获取真核生物的目的基因，但是由于高等真核生物基因组DNA文库比其cDNA文库大得多，相关工作量同样大得多。更为重要的是，在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，但在大肠杆菌等原核生物中没有类似序列的存在，所以大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列，即不能表达真核生物DNA。而在真核生物成熟mRNA中已不存在间隔序列（已在拼接过程中被去除），所以可以以真核生物成熟mRNA为模板，逆转录而成的cDNA可被大肠杆菌表达。因此，在基因工程中，cDNA文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法。

3直接分离基因最常用的方法是“鸟q法”，又叫“散d射击法”。这种方法有如用猎q发射的散d打鸟，无论哪一颗d粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟q法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法吧带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。

用“鸟q法”获取目的基因的优点是 *** 作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。

人工合成

1(主要是序列已知的基因)。主要是通过DNA自动合成仪，通过固相亚磷酸酰胺法合成，具体过程可以网上查询，反正是可以按照已知序列将核苷酸一个一个连接上去成为核苷酸序列，一般适于分子较小而不易获得的基因。对于大的基因一般是先用化学合成法合成引物，再利用引物获得目的基因。

2聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑

他只是给目的基因的扩增

用dna探针从基因文库中准确提取目的基因，由于dna双链的核苷酸序列是彼此互补的，当dna分子杂交时，首先是双链解开（该过程称为变性），根据所需基因的核苷酸序列制成一段与之互补的核苷酸短链，并用同位素标记，即成为探针。用这一探针探查基因文库中已经变性的dna片段，如果有一个dna片段能和探针片段互补结合而成双链（分子杂交），这一片段即含有所需要的基因。

从基因文库中找所需要的目的基因，就是要根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mrna，以及基因翻译产物蛋白质等特性来获取目的基因。此法较为复杂。

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