miRNA专家谈之三：如何上调或下调特定的miRNA

miRNA通过与转录本的相互作用，关闭或抑制基因的表达。最近的研究表明它们影响了约三成的基因。miRNA在多个组织中差异表达，这就让表达图谱分析成为研究的重点。同时，miRNA的过表达和抑制也是近年来常用的研究方法。然而，Peng Jin(埃默里大学)我们使用RNA oligo和载体的方法。对于RNA oligo方法，我们采用类似siRNA双链的miRNA，及anti-miRNA来增加或阻断特定miRNA的活性。这种方法便于 *** 控细胞培养中特定miRNA的活性。载体方法有着长期改变的优势，能够追踪个别细胞。我们利用人工的shRNA质粒或Pol II表达载体，来过表达特定的miRNA。对于miRNA的下调，我们要么表达一个shRNA，它能产生与miRNA前体的茎环结构互补的siRNA，要么使用miRNA海绵(miRNA sponge)，它能在特定miRNA的多个目标位点表达报告基因。Winston Kuo(哈佛大学)目前有两种通用策略：1) 基于载体或病毒的miRNA或miRNA反义链序列的过表达;2) 外源miRNA双链或反义抑制剂的转染。方法的选择取决于实验的设计。一般说来，我们倾向于外源试剂的转染。载体/病毒的策略还依赖Drosha/Dicer酶对转录本的顺序加工，且必须通过Exportin 5从核中输出。在人类癌细胞系中曾报道过Drosha和Dicer水平的miRNA加工缺陷。此外，Exportin 5也被认为是细胞和小鼠模型中miRNA生物发生途径的瓶颈。外源过表达可饱和Exportin 5，从而胜过内源小RNA序列。极端的情况下会引起细胞或动物死亡。外源双链转染后，直接进入RISC复合物中，因而绕过了这些陷阱。当然，在需要持久的功能获得或功能丧失时，还需要载体或病毒的稳定表达。稳定的细胞系必须小心地建立，采用病毒滴度测定来避免上述问题。Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)对于miRNA的上调，我们常常构建表达载体。制备起来非常简单。我们只是扩增miRNA发夹结构及一些侧翼序列，并直接克隆PCR产物。有时候，我们也用合成的miRNA模拟物来瞬时转染细胞，以过表达miRNA。为了抑制miRNA，我们一般使用市场上的反义寡核苷酸。我们使用Dharmacon和Exiqon的抑制剂都获得了成功。这些试剂的局限在于它们只能瞬时作用。为了实现稳定抑制，我们开始用所谓的miRNA海绵。它们实际上是有着多个miRNA结合位点的捕获转录本，能隔离细胞中有活性的miRNA。Silvia Monticelli(瑞士生物医学研究所)我们主要使用慢病毒或反转录病毒系统，因为我们主要研究原代细胞，而且需要长时间的持续表达。取决于细胞类型，我们也使用lipofectamine或Amaxa来瞬时转染。对于下调，我们正使用miRNA海绵。对于短期研究，miRNA抑制剂的瞬时转染效果也很好。Galina Gabriely(哈佛大学)为了评估处理后miRNA的活性，我们测定了与miRNA结合位点融合的萤光素酶的表达。不过，评估miRNA活性的最佳方法是评估它的天然靶点的表达(如果miRNA靶点已知)。这可以通过western blot分析来进行。miRNA表达的调节可用northern blot分析来评估miRNA的表达水平。在某些情况下，定量RT-PCR也能给出miRNA表达的可靠结果，但miRNA调节所使用的寡核苷酸会在PCR反应中干扰引物，从而影响真实的表达数据。Winston Kuo(哈佛大学)我们使用几种策略，包括miRNA qPCR，miRNA northern blot，萤光素酶报告分析，mRNA靶点的qPCR，以及蛋白靶点的western blot。在上面我已经讨论了miRNA qPCR和northern blotting。这些能够直接检测miRNA过表达或下调。萤光素酶报告分析包括3’-UTR序列克隆在萤光素酶编码序列的下游。这些3’-UTR包含了人工的miRNA同源位点或已验证mRNA靶点的内源序列。后一个策略中的关键对照是生成假定同源位点上种子序列的点突变。这些点突变将使miRNA不能调节萤光素酶的表达。Joshua Mendell(约翰霍普金斯大学)为了验证miRNA上调，我们还是使用northern blotting或实时定量PCR来测定miRNA的丰度。测定miRNA的抑制就没那么简单。反义oligo确实降低了miRNA的丰度。因此，你也可以用同样的方法来监控miRNA抑制。不过，体内miRNA的隔离不会总是让miRNA丰度下降。另一个方法是用报告基因重组子来监控miRNA的抑制。miRNA会抑制报告基因的表达，除非它的活性受阻。当然，这种报告基因的使用一般受限于细胞培养环境。Silvia Monticelli(瑞士生物医学研究所)这些实验中的关键一步是：通过转染或转导细胞，你有效地改变了它们，因此你的确需要很多对照，来确认你所看到的结果是来自miRNA的表达或下调。这对miRNA尤其重要，因为在很多情况下，你并不期待一个强的表型，但是你在寻找微调基因表达的温和效果。我想你至少需要目的miRNA之外的miRNA和种子区域的突变体。我还推荐使用不同方法来设法获得相同的结果。

miRNA深度测序你意思高通量测序吧。技术特点没什么可说的，如果你了解高通量测序的流程的话。

mirna一般是通过割胶回收短序列RNA，建好mirna的文库后，进行高通量测序。只不过mirna测序分析有一些特点，比如说mirna的预测，以及靶基因的预测（主要基于数据库比对和mirna的前体的发卡结构）。

外泌体和其他小的胞外囊泡(sev)提供了一种独特的细胞间通信模式，在这种模式中，从一个细胞产生和释放的microrna(miRNAs)被远处的细胞吸收，在那里它们可以引起基因表达的变化。然而，mirna被分选到外泌体/sev或保留在细胞中的机制仍在很大程度上未知。

在这里，我们证明了miRNA具有分选序列，决定其在sEV（EXOmotifs）或细胞保留(CELLmotifs)中的分泌，并且不同的细胞类型，包括白色和棕色脂肪细胞、内皮、肝脏和肌肉，优先使用特异性分选序列，从而定义该细胞类型的sEVmiRNA谱。

为了研究miRNA细胞保留和外泌体/sEV释放的具体特征，我们从5个小鼠细胞系中分离出了外泌体/sEV，这些细胞系代表了参与代谢调节的重要组织：

不同类型的细胞释放不同数量的sev，3T3-L1脂肪细胞的产生和释放率最高，C2C12肌管的释放率最低；这与观察到的脂肪组织是体内循环外泌体/sEVmirna的主要贡献者相一致

在所有病例中，sev的直径为50-200nm。

富集经典的外泌体标记物ALIX、TSG101、CD9和CD63，而细胞标记物GM130和CANX基本没有

这些sev的RNA含量与释放的囊泡总数相平行

使用基于实时荧光定量PCR(qPCR)的阵列评估分泌的sev及其来源的细胞的miRNA组成(图1a)。与预期的一样，细胞miRNA的主成分分析(PCA)显示，尽管棕色和白色的脂肪细胞和内皮细胞聚集在一起，而肝细胞和肌细胞更为不同，但每种细胞类型都有不同的miRNA谱。

当PCA同时包括细胞和sEVmiRNA时，sEVmiRNA彼此之间以及与其来源细胞中的miRNA有很大的不同(图1b)，突出了miRNA分泌的特殊性

然后，我们比较了每种细胞或sEV类型中每个miRNA与其他类型的水平。在细胞体中评估的664个miRNAs中，有210个miRNAs（32%）在一种细胞类型中的表达明显高于其他四种细胞类型

同样，与其他细胞类型的囊泡相比，大约三分之一的sEVmiRNAs（218/660）在一种细胞类型的囊泡中富集，可用于预测来自不同器官的混合sev中的组织来源，如在血液中。

一些sev特异性的miRNA反映了miRNA的细胞类型特异性，例如，miR-133a/b，它在C2C12肌管中特异性表达。

然而，对于每种细胞类型，73-92%的被认为是针对特定细胞类型的sEVmiRNAs也在其他细胞类型的细胞体中以类似或甚至更高的水平表达，提示了一种细胞类型特异性的分类机制。同样地，在两种不同细胞类型的sev中同样丰富的miRNA在两种分泌细胞类型中可能有相当不同的表达水平。因此，确定sEVmiRNA的组织起源并不像知道miRNA在哪个组织中高表达那么简单（上图e）。

通过比较细胞体中每个miRNA与sev的相对水平可以揭示miRNA分泌和保留的独特模式。

与细胞体相比，一些mirna在所有五种细胞类型的sev中均富集，而其他的则在只有一种或两种细胞类型的sev中表现出选择性富集，还有一些发现在sev中很少或根本没有发现，尽管它们存在于细胞体中。

将sEV中miRNA的相对丰度除以其在细胞体中的相对丰度(sEV富集)，表明sEV和细胞中miRNA的分类存在大量差异，一些miRNAs在sEV中明显富集，而另一些在细胞体中明显富集（保留）

为了确定miRNA分选的潜在机制，我们分析了显示sEV或细胞体富集的miRNA的miRNA序列和结构。5p和3pmiRNAs没有普遍富集（补充表6）。然而，与细胞中保留的序列相比，sEV富集水平更高的miRNA序列具有更高的G+C含量和更低的吉布斯自由能(ΔG)(扩展数据图2c，d)

识别潜在的差异分选miRNAs序列，我们分析在sEV或细胞体中富集的miRNAs的序列，将它们与未显示出优先sEV分选或细胞保留的mirna序列进行比较。

嘿嘿，这个很简单，我来告诉你：你首先登入mirbase数据库，进入到download页面，其实就是这个网址：>

microRNAs（miRNA）是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链），但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNA）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA接到的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中发现的lin－4和let－7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNA。miRNA有高等生物基因组编码,通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译。其在物种进化总相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNAs只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中其多种作用。microRNAs的作用机制miRNA是一类多细胞动物或植物基因组的前体mRNA内含子，miRNA独立转录单位或miRNA基因簇编码的19-25个核苷酸大小的内源性单链RNA，他们在转录后水平沉默特定基因从而对生物体基因表达起到精细调节的作用[1]。绝大多数miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成较长的茎环结构，称为初级miRNA（primary miRNA ,pri- miRNA）。pri- miRNA在Drosha-DGCR8复合体的作用下形成长度约60-70个核苷酸的发夹状RNA，成为前体miRNA（precursor miRNA,pre-miRNA)。随后，pre- miRNA在Exprotin－5复合物[2]的作用下被转运出胞核，在胞浆中由Dicer剪切成为miRNA复合体， miRNA复合物（RNA－induced silencing comlex，RISC）[1]与该miRNA的3’翻译区（3’UTR）结合到位于胞浆的P－body（processing bady）中[3]：如果miRNA与靶mRNA匹配完全，则该复合体降解mRNA；若两者序列部分匹配，尤其是miRNA的5’端2-8个被称为种子序列（seed sequence）的核苷酸与靶mRNA匹配完好，则通过抑制靶mRNA的翻译来沉默特定基因。此外，某些miRNA，如miRNA－16能够特异结合于某些基因3’UTA的富含AU元件（AU rich element,ARE）,指导Ago等组成RISC区的蛋白与TTP结合，从而改变相应mRNA的半衰期，加速靶mRNA的降解。此外，miRNA也可能抑制5’UTR含有内部核糖体进入位点（intrnal ribosome entry sites,IRESs）的靶标分子[4]。miRNA的表达调控机制①顺时调控元件 大多数miRNA基因的核心启动子区域含有TA盒，并且含有影响miRNA表达的细胞特异转录调节元件。miRNAs作为转录因子重要的靶分子在细胞功能调控中发挥核心作用。②表观遗传学 最近一些研究提示，表观遗传学变化会影响miRNA 基因，从而调节miRNA表达。分析基于miRNAse（release 80）数据库的332个人miRNA基因序列时，发现其中155个miRNA的基因序列上游或下游2000bp处含有CG岛在miR-127[6],miR-24a[6],let-7a-3[7]和miR－370[8]基因中，均含有CpG岛，并且在相应地肿瘤组织中呈现高度甲基化，这些miRNA在肿瘤中的甲基化沉默将导致他们的靶基因－原癌基因（BCL6，CDK6和MAP3K8等）的表达，从而促进肿瘤发育。转录因子PRDM5可能参与了调解miRNAs基因的表观遗传学变化。在HEK293细胞中，PRDM5可以募集蛋白甲基化转移酶G9a和一类组蛋白去乙酰基酶等组蛋白修饰到has－mir－135b基因的启动子区域，行使抑制功能[9],miRNA在癌症细胞中的表达一般低于正常组织细胞，这表明多数miRNAs可能作为肿瘤抑制因子而发挥作用。原癌基因的低度甲基化和肿瘤抑制基因的高度甲基化被认为是癌症表观遗传学的主要决定因素。miRNAs基因在肿瘤中的异常甲基化使表观遗传学调控癌症机理更加复杂。③单核苷酸多态性 存在于pri－mRNAs，pri－mRNA或成熟miRNAs基因序列中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）能够潜在地影响miRNA调节的细胞功能网络。miRNA基因或靶结合位点及其临近靶位点区域的多态变化时，于miRNA的生物合成及靶位点选择和抑制效应据重要的意义。④RNA编辑 （RNA editing）是基因在初级转录物上增删或取代某些核苷酸而改变遗传信息的过程，从而可调节基因的表达。RNA编辑在miRNA调控基因默过程中其重要作用，不仅影响miRNA表达，而且影响特异miRNA的靶向分子的调控。此外，At编辑也有可能存在于靶分子的种子互补区域。

        植物miRNA受HEN1催化的3'端2'-O-甲基化作用而免受降解。拟南芥中HEN1的缺失导致大多数miRNA的积累减少以及miRNA大小异质性。水稻中也观察到了类似的结果。对拟南芥 hen1 突变体的进一步研究发现，3'至5'的截短和3'的尿苷化是miRNA降解的两个主要机制（图1）。实际上，这些机制也可用于动物体内的piRNA降解，例如果蝇、秀丽隐杆线虫、斑马鱼、小鼠。因此，小RNA的3'甲基化是保护它们免于降解必不可少的普遍机制。尽管已经确定了小RNA降解所需的其他几个基因，但小RNA周转的全部范围仍不清楚。

        在拟南芥，水稻和玉米中，在 hen1 突变体中广泛观察到miRNA的3'尿苷化。拟南芥中的核苷酸转移酶HEN1 SUPPRESSOR 1（HESO1）和UTP：RNA URIDYLYLTRANSFERASE（URT1）将3'没有甲基化的miRNA尿苷化并促进其降解。 heso1 ， utr1 突变体会减弱miRNAs尿苷化的降解； hen1 突变体中，3'尿苷化程度增加且发育缺陷。在体外，HESO1和URT1具有向未甲基化的RNA添加U残基的能力，而RNA的3'甲基基团抑制了它们的活性。有趣的是，它们对体内miRNA底物有不同的偏好：HESO1和URT1分别偏爱U端和A端miRNA，这使未甲基化的miRNA（尤其是A端miRNA）。经历URT1催化的尿苷化，这使它们被HESO1的青睐。

        还已经鉴定出负责小RNA降解的核酸外切酶。反向遗传筛选和体外酶法测定表明，小分子降解核酸酶1（SDN1）表现出3'至5'核酸外切酶活性，并特异性地作用于短ssRNA 。 SDN1属于一个包含四个成员的家族。三个SDN成员的突变会导致严重的形态异常，并增加miRNA和siRNA的积累，表明SDN成员在降解小RNA方面具有冗余功能。尽管小RNA的3'甲基部分抑制核酸外切酶的活性，但已证明在hen1和野生型植物中，miRNA的3'截短均由SDN进行。通过比较miRNA图谱，在 hen1 突变体或缺失SDN1和SDN2的野生型植物中观察到3'截短的miRNA的积累减少。

        由于尿苷酸化的miRNA不能在体外被SDN1降解，因此应该有其他核酸外切酶降解尿苷化的miRNA。在其他真核生物中，已经鉴定出了几种以尿苷酸化的RNA为底物的核酸外切酶，eg：在哺乳动物中，DIS3-like2（DIS3L2），其在酵母中的直系同源物也能够降解尿嘧啶化的RNA ;在衣藻中，外泌体subunit Ribosomal RNA-Processing Protein 6（RRP6）表现出3'至5'核酸外切酶活性，并特异性作用于尿酸化的miRNA。体内RRP6的去除会导致小RNA的丰度增加，这暗示RRP6可能是降解尿苷化miRNA的核酸外切酶。因此，研究RRP6和DIS3L2的直系同源物将加快拟南芥中有利于尿酸化miRNA的核酸外切酶的发现。

      除了SDN1，HESO1和URT1在体内与AGO1相互作用。在体外，这三种蛋白质都能够尿苷化或截短与AGO1相关的miRNA，而修饰的miRNA保留在AGO1上。由于miRNA3'甲基化抑制了HESO1和URT1的活性，miRNA的3'甲基仅部分作用于SDN1 ，因此在AGO1结合的miRNA降解期间，SDN1去除miRNA的3'甲基，使未甲基化的miRNA有利于HESO1和URT1进行尿苷化，并且有未鉴定的核酸外切酶x降解U尾miRNA。此机制也可能适用于游离miRNA，或者SDN1可以直接降解游离miRNA。

Mode of action of miRNAs

植物miRNA转录后调控基因表达主要通过清除转录本和抑制表达两种机制。

miRNA-guided transcript cleavage

        通过序列互补识别靶标后，miRNA介导AGO1在靶标转录本miRNA的第10和11个核苷酸相对应的磷酸二酯键处裂解。 除了AGO1，其他AGO蛋白，包括AGO2，AGO4，AGO7和AGO10，也被证明具有裂解活性，这由AGO蛋白中的RNase H-like PIWI结构域决定的。

miRNA-mediated translation repression

        miRNA介导的转录物切割的广泛存在，植物中很少观察到miRNA指导的翻译抑制，eg： miR172和miR156 / 157分别调节AP2和SPL3是通过翻译抑制实现的。当miR172和miR156 / 157异常积累时，AP2和SPL3的转录本水平却与野生型相似，蛋白质水平发生了变化，于是有人提出miRNA介导的翻译抑制。后来，据报道还有其他几种miRNA以类似的方式调节其靶标，例如miR159 ，miR164，miR165 / 6 ，miR171，miR395，miR398和miR834 。而且，已经表明，miRNA通过抑制蛋白质合成而不是促进蛋白质降解来抑制其靶标的翻译。

        已经确定了与miRNA指导的翻译抑制有关的几个因素，包括微管切断酶KATANIN 1（KTN1）；加工体（P体）的组成部分VARICOSE（VCS）； 一种GW重复蛋白SUO；以及ER膜蛋白ALTERED MERISTEM PROGRAM 1（AMP1）。如果这些基因突变会改变miRNA靶标的蛋白质水平，而不会影响它们的转录水平，表明miRNA介导的翻译表达与转录物的切割无关。而且，大多数miRNA富集于膜结合的多核糖体上，这表明miRNA指导的转录物切割和翻译抑制在ER上发生。然而，转录物的切割也可能以与胞浆中多核糖体无关的方式发生。

miRNAs in plant development

miRNA介导的调控产生的影响被广泛研究。 植物中的许多miRNA靶标是调节多种生物过程的转录因子，包括莲座丛叶和根的发育，花的形态发生，茎顶端优势，激素信号传导，对干旱和高盐度的非生物胁迫响应以及植物对病毒和细菌的免疫。很多研究揭示了miRNAs在植物发育过程中的生物影响（图2，表1）

miRNA-mediated regulation of meristem organization and cell polarity

植物分生组织在可能在特定的生长区域中包含未分化的细胞。分生组织的细胞分化生成植物器官，并且细胞分化过程在分子水平上受到严格调节。作为基因表达的关键调控因子，miRNA及其功能是分生组织维持不可或缺的组成部分。植物的叶子从茎尖分生组织的外围区域产生，形成叶面叶腹，前后-轴和中-外极化结构。随着细胞分裂，扩展和分化，叶片发育不断发展。已知有几种miRNA可以调节分生组织的维持和叶片模式。 

花的发育是植物生长的重要阶段，它包括从营养生长到生殖生长的过渡。在拟南芥中，miR156/157，miR159和miR172等miRNA家族在开花过程中表现出调节功能。 miR156/157家族有10个保守的成员miR156a-h和miR157a-d，它参与生殖阶段的过渡。在此过程中，miR156/157的丰度下降，导致其靶基因 SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE(SPL） 的表达增加。一致地，miR156/157过表达导致开花延迟。单子叶植物中的miR156似乎参与了辅助分生组织的启动。在柳枝中，miR156-SPL调节分蘖。在玉米中，miR156调控 TSH4 可控制穗发育，这是谷物形成的重要过程；miR156-SPL还涉及植物中衰老途径的控制。在番茄中，响应赤霉素（GA）信号，miR156与miR319介导的途径一起调节了向开花的过渡，整合了两个无关的miRNA功能。

miR159参与了短日照条件下的开花期，通过GAMYB相关基因促进花期转变， MYB33 / 65/1101 是影响LEAFY活性的GA特异性转录因子。miR172通过其靶标 APETALA 2（AP2） 的翻译抑制参与花的发育。 miR172对开花的抑制作用在玉米，大麦，大豆和水稻中得到保留。

miRNA-mediated regulation of root architecture

植物根系能够吸收水分和养分，也是与土壤环境相互作用的场所。 根的发育受多个因素的精确调控。 在植物中，已知一些小RNA及其靶标参与侧根发育。 这些包括miR164及其靶标，即植物特异性转录因子 NAC1 DOMAIN CONTAINING PROTEIN 1 (NAC1) 它调节拟南芥和玉米的侧根形成。 同样在渗透胁迫下，过表达马铃薯中Stu-miR164导致StNAC262的表达减少，并限制了侧根的数量。 MIR165/166 编码的miR165a, miR166a, and miR166b在根分生组织的表皮中表达，限制靶基因 PHABULOSA（PHB） 在中央根细胞层中的表达，从而塑造根结构。 miR390在侧根起始位点的特异性表达触发了tasiRNA的产生，从而抑制ARF2/3/4，控制了局部生长素调节网络。反过来，miR390受到 ARF4 的抑制，和其他ARF的正调控。 miR390和ARF2/3/4之间的正负反馈环路定义了miR390的正确定位，并进一步调节了侧根的发育。 miR160靶向 ARF10 和 ARF16 并在根冠形成过程中发挥调节功能。另外，在胁迫条件下，miR393被诱导并切割生长素受体 TIR1 和 AFB2 的转录本，从而影响侧根的发育。

 miRNA也参与与土壤环境的根部共生。在藜苜蓿中，miR169通过将 HAP2-1 （CCAAT结合家族的转录因子）的表达限制在结节区域来影响结节细胞的分化。 miR319d-TCP在大豆和根瘤菌之间的固氮过程中发挥作用。在大豆中，miR393调节植物生长素信号传导中的 GmTIR1 和 GmAFB3 ，该调节对于确定结节发育至关重要。有趣的是，过表达miR390促进侧根生长，但抑制结节形成，表明miR390- ARF 模块在这些发育过程中具有相反的功能

miRNA-mediated regulation of seed development

在一部分陆地植物中，种子是施肥的产物。在种子产生，成熟和萌发过程中起作用的miRNA包括miR159，miR160，miR165 / 166，miR395，miR402和miR417 。在拟南芥中，针对MYB33/65的miR159a/b调控种子的大小和形态。 miR172-AP2还参与确定种子大小，重量以及油和蛋白质含量。在拟南芥和番茄中，miR167-ARF6/8途径似乎可以调节种子的分散和花器官的发育。miR160的靶标ARF10会影响种子发育，因为该基因的沉默会导致扭曲的种子角果。拟南芥miR165/166的丧失导致种子萌发和幼苗早期对ABA的超敏反应。在甘蓝型油菜中，由于无机磷酸盐/铜不足，miR2111，miR399，miR827和miR408的表达增加限制了角果的生长。

在水稻中，miR156调控 SPL 基因会影响籽粒大小和穗分枝。具体而言，OsSPL13正向地调节晶粒长度和晶粒厚度，而OsSPL16负向地调节晶粒长度，但正向地调节晶粒宽度。miR396和miR397分别靶向 OsGRF4 和 OsLAC 来调节颗粒大小。就谷物品质而言，过表达osa-miR5144导致其靶基因 OsPDIL1; 1 的水平降低，这是蛋白质二硫键含量调节和谷物中散装淀粉颗粒形成的关键催化剂。

对过表达miR393和靶标模拟研究表明，它通过靶向两种TIR1 / AFB生长素受体来发挥其在大麦种子发育中的作用。 此外，发育和萌芽的大麦种子的胚胎中富含miRNA，例如miR156，miR168，miR166，miR167和miR894，以及大麦特异性miR5071，它们可能通过靶向作用参与防御反应。 类似OsMLA10的基因。 因此，这些miRNA在胚胎发育过程中可能具有重要的调控作用。

受一作者启发，找到了这本《Plant Small RNA》，并阅读其中内容巩固知识，发布出来为了在疫情这段放假时间督促自己学习，如有批评指正，不胜感激～

多个研究小组采用生物化学结合生物信息学的方法开展对miRNAs的研究工作。由于据推测都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—25个碱基大小、有5’端磷酸基和3’羟基的RNA片断，有的实验室采用改良的定向克隆方法来筛选具有相同特征的小分子——筛选一定大小的RNA分子，连接到3’和5’的适配子(adapters)，逆转录并通过PCR扩增、亚克隆并测序。miRNA前体在基因组上的定位和聚类是通过向基因组数据库查询进行。这个方法有助于判断miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解产物。 有的实验室通过一种RNA folding program ’mfold’ 来判断C elegans 和C briggsae 之间的高度保守区域是否含有潜在的miRNA前体，然后用Northern Blots的方法来确定这些miRNAs是否真的表达了。 尽管有数百个miRNAs通过生化或者是生物信息学的方法被鉴别出来，已经鉴别出来的miRNAs只不过是沧海一粟，由于很多已经鉴别出来的miRNAs是从单个克隆中鉴别出来的，所以可以假设还有很多miRNAs在分离和鉴定过程中被“漏掉”了，测序工作还远远不够。 生物信息学方法是依据在不同的物种中，其成熟的miRNA 具有较大的序列同源性以及前体的茎环结构具有相当大的保守性这一特征在基因组数据库中搜索新的miRNA 基因。该方法根据比较基因组学原理并结合生物信息软件在已测序基因组中进行搜索比对，根据同源性的高低再进行RNA二级结构预测，将符合条件的候选miRNA与已经通过实验鉴定的miRNA分子进行比较分析，最终确定该物种miRNA的分布及数量。近年来随着miRNA预测方法的不断发展，人们发现的miRNA数量呈几何级数增长。这些预测方法从简单的序列比对搜索发展到现在的机器学习算法，程序设计越来越智能化，复杂化。 随着人miRNA基因转录出的pri-miRNA迅速加工成具有茎环结构的pre-miRNA，随后被切割成miRNA：miRNA双体，并被选择性地组合进核糖核酸沉默诱导复合体(RISC)并进行靶基因识别。在相似的物种中，miRNA是很保守的;但在相距较远的物种间，miRNA又有一定的分歧，尤其体现在pre-miRNA上。这些miRNA功能作用机制的阐明为预测软件(表11)的研发提供了理论依据，但仍需要不断修补和完善。 你可以到生物帮那里看看，那里有覆盖所有实验领域的精品技术文件，图文并茂的提供生物领域的学科知识、实验技术方法与技巧等，看看 >

请问将二代测序得到的序列比对到miRBase鉴定已知miRNA时，应选择miRBase中的mature序列还是hairpin序列啊？

看到miRBase中同时有hairpinfa和maturefa两个数据文件，迷惑了

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