苦参碱抗肿瘤作用及其机制的初步研究中华首席医学网2007年11月01日 22:35:18 Thursday 点击次数：22
作者：马玲娣 张彦 文世宏 何於娟 刘小珊 康格非 蒋纪恺
作者单位：南京医科大学附属常州第二人民医院中心实验室，常州 213003
《中国免疫学杂志》2007年5月23卷5期 中医中药与免疫
加入收藏夹 【摘要】 目的：研究中药苦参碱（Matrine）的抗肿瘤作用及其免疫学机制。方法：MTT比色法检测肿瘤细胞的生长抑制率；流式细胞术分析细胞周期的改变。建立荷瘤小鼠模型，观察小鼠肿瘤的生长情况,计算肿瘤生长抑制率；MTT法测定苦参碱对荷瘤小鼠PBMC体外增殖作用的影响；ELISA法检测苦参碱治疗后小鼠血清中IL�2和IL�12的活性。结果：苦参碱可显著抑制小鼠肿瘤细胞的体外分裂和增殖，且抑制作用呈浓度和时间依赖性，使G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，细胞增殖指数降低。苦参碱对小鼠实体瘤生长具有显著抑制作用，抑瘤率高达60.7%以上；明显抑制小鼠静止PBMC的体外增殖作用；不能提高荷瘤小鼠血清中IL�2和IL�12的含量。结论：苦参碱具有较强的抗肿瘤作用，体内体外却表现出一定的免疫抑制作用，提高机体的免疫功能不是苦参碱发挥抗癌活性的主要机制。
【关键词】 苦参碱；肿瘤；免疫调节
Preliminary studies on anti�tumor activies of matrine and its immunological mechanism
MA Ling�Di, ZHANG Yan, WEN Shi�Hong, HE Yu�Juan, LIU Xiao�Shan, KANG Ge�Fei, JIANG Ji�Kai.
The Central Laboratory, the Second Changzhou Hospital, Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Changzhou 213003, China
〔Abstract〕 Objective:To explore the inhibitory effects of matrine on tumor growth and the possible mechanisms related to immunological functions.Methods:The tumor cell growth repression rate was measured by MTT colorimetry. Flow cytometry was used to analyze the cell cycle of H22 cells. The H22 BALB/c xenograft tumor models were established. The anti�tumor effect of matrine was observed and tumor growth inhibitory rate(IR) was calculated. The effect of matrine on the proliferation of peripheral blood mononuclear cell(PBMC) separated from H22 tumor�bearing BALB/c was determined by MTT assay in vitrothe content of serum IL�2 and IL�12 were examined by ELISA assay.Results:Matrine inhibited proliferation of the H22 tumor cells in both time and concentration�dependent manners, with increased the cell numbers at G1 phase and decreased numbers at S and G/M phase showing the possible mechanism for lowering cell proliferation rate. The tumor inhibition rate of matrien came up to 60.7% in tumor�bearing mice. Matrine significantly suppressed the proliferative activity of PBMC from tumor�bearing mice. Furthermore, martine could not increase the contents of murine serum IL�2 and IL�12.Conclusion:Matrine could inhibit tumor cell growth directly but not exert the anti�tumor efficiency through reinforcing the immune function.
〔Key words〕Matrine；Tumor；Immunoloregulation
苦参碱是我国传统中药苦参中提取出的一种主要的活性成分，具有消炎抗菌、抗过敏、抗心率失常等多种药理学作用〔1，2〕。我们多年来的研究表明，苦参碱在体外可诱导人白血病细胞K562向正常形态分化，有效抑制K562细胞的体外增殖〔3，4〕。随着对苦参碱提纯和药效作用的深入研究，发现苦参碱还具有抗肿瘤作用，但目前对苦参碱抗肿瘤尤其是抗实体瘤方面的研究还不够深入，其体内外的抗肿瘤机制仍不明了，尤其是与荷瘤机体免疫功能之间的关系还是未知。为了认识苦参碱抗癌作用的机理和特点，我们选用小鼠H22肝癌细胞为研究对象，建立荷H22肝癌移植瘤小鼠模型，观察了苦参碱对H22细胞的抑制作用和其对荷瘤小鼠免疫功能的影响，以期探讨苦参碱抑瘤作用与机体免疫功能之间的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
苦参碱购自陕西省科学院西安植物园植物化学开发研究所，纯度为99.9%；RPMI1640培养基Gibco公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；刀豆蛋白A(Con A)及MTT〔3�(4,5)�双甲基�2�噻唑�(2,5)�二甲基溴化四氢唑盐〕均为美国Sigma公司产品；小鼠淋巴细胞分离液：天津灏阳生物制品科技有限责任公司出品；IL�2和IL�12 ELISA kit购自广州晶美生物过程有限公司；环磷酰胺（CTX）为上海华联制药有限公司产品，200 mg/支，批号000211；H22腹水型小鼠肝癌细胞由重庆医科大学基础医学院病理生理教研室惠赠；SPF级BALB/c小鼠，重庆医科大学实验动物中心提供；96孔细胞培养板：丹麦Duke公司；CO2培养箱：德国Heraeus公司；光学显微镜：日本Olympus；酶联免疫吸附检测仪美国Bio�Rad MODEL550型；电子数显游标卡尺：广州一途电子有限公司YT�203型。
1.2 方法
1.2.1 苦参碱对H22细胞生长的影响
收集对数生长期H22细胞，调整浓度为5×104 ml-1，接种于96孔细胞培养板中，每孔200 μl，实验分为实验对照组（只加试剂）和阴性细胞对照组（只加RPMI1640培养液）。实验组中加入终浓度分别为0.2、0.5、1.0、1.5和2.0 mg/ml的苦参碱。每种浓度均设8个平行孔。培养板置于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中常规培养44小时后，离心弃上清，各孔均加入RPMI1640 200 μl，5 mg/ml MTT溶液20 μl，继续培养4小时，离心弃上清，加入二甲基亚砜200 μl，振荡器上振荡5分钟溶解蓝色结晶，混匀后以酶标仪于570 nm处读取各孔吸光度值（A570），计算肿瘤细胞的生长抑制率。
细胞生长抑制率(%)=1-实验组A570均值对照组A570均值×100%。
1.2.2 苦参碱对H22细胞周期的影响
取对数生长期H22细胞，调整浓度为3×105 ml-1/20 ml，接种于100 ml细胞培养瓶中，加入苦参碱，使其终浓度分别为0.5、1.0和1.5 mg/ml，37℃、饱和湿度、5%CO2培养48小时后收获细胞，PBS洗涤2次，70%冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶（PI）室温染色30分钟后，经流式细胞仪检测细胞周期时相分布，计算细胞增殖指数（PI）。
PI(%)=S+G2/MG1+S+G2/M×100%。
1.2.3 荷H22肝癌移植瘤小鼠模型的建立
对数生长期H22细胞，以RPMI1640调整细胞浓度为5×106 ml-1，于BALB/c小鼠左侧下腹部行无菌皮下接种，接种量为0.2 ml细胞悬液，细胞总数为1×106个。接种24小时后称重分组，将BALB/c小鼠随机分为4组：苦参碱高浓度组（Mhigh）和低浓度组（Mlow），给药量分别为50 mg/kg体重和100 mg/kg体重；阳性对照组给予20 mg/kg体重的CTX；阴性对照组（N.S control）给予等量无菌生理盐水。每组小鼠20只，每日以腹腔注射（i.p）方式给药，0.2 ml/只，隔日1次，连续注射7天。
1.2.4 苦参碱对H22荷瘤小鼠移植瘤生长情况的影响
停药后次日处死小鼠，剥出瘤体称重，计算肿瘤生长抑制率(IR)。
抑瘤率（%）=对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重对照组平均瘤重×100%。
1.2.5 苦参碱对荷瘤小鼠PBMC体外增殖反应的影响
1.2.5.1 小鼠外周血单个核细胞(PBMC)的分离〔5〕
BALB/c小鼠颈椎脱臼致死，无菌取脾，盛有无菌Hanks液的平皿中轻轻捻碎脾组织，以250目不锈钢筛网过滤，收集得到脾细胞悬液。用小鼠淋巴细胞分离液按常规方法操作，分离得到小鼠PBMC悬液。台盼蓝染色计数活细胞数95%以上，以含10%胎牛血清的RPMI1640配成1×106 ml-1细胞悬液。
1.2.5.2 苦参碱对荷瘤小鼠PBMC体外增殖反应的影响〔6〕
试验组为含有5 μg/ml ConA的小鼠PMBC悬液，内加入不同浓度的苦参碱溶液，使其终浓度分别为100、200和500 μg/ml。阳性对照组仅含5 μg/ml ConA，空白对照组为加入等体积PBS溶液。将上述细胞悬液分别加入到96孔细胞培养板中，每孔200 μl，试验组和对照组均设6个复孔(n=6)。加好样品的96孔培养板置于37℃、5%CO2的孵箱中培养72小时, MTT法步骤同前述。根据以下公式计算刺激指数(SI)：
SI(%)=实验孔A570均值对照孔A570均值×100%。
1.2.6 苦参碱对荷瘤小鼠血清中IL�2和IL�12水平的影响〔7〕
各组小鼠停药后次日摘眼球放血，静置后离心(3 000 r/min，10分钟)分离血清。ELISA法检测荷瘤小鼠血清中IL�2和IL�12的活性。
1.2.7 统计学处理
实验数据以x±s表示，多组间差异性比较采用方差分析（one way ANOVA），使用SPSS 10.0统计学软件进行分析。
2 结果
2.1 苦参碱对H22细胞生长的抑制作用
0.2 mg/ml苦参碱作用于H22细胞48小时后，细胞生长被抑制2%左右，0.5、1.0、1.5和2.0 mg/ml苦参碱均可显著抑制H22细胞的增殖，生长抑制率分别为15%、54%、86%和92%，且抑制作用呈剂量�效应依赖性，见表1，提示苦参碱可直接杀伤体外培养的H22细胞，具有较强的细胞毒作用。表1 苦参碱对H22细胞的增殖抑制作用（略）
2.2 苦参碱对H22细胞细胞周期的影响
0.5、1.0和1.5 mg/ml苦参碱作用48小时后G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，作用具有明显的剂量依赖性，见表2，显示苦参碱可有效抑制细胞周期的正常转换，使细胞在G1期堆积，细胞阻滞于G2/M期，从而阻止细胞的有丝分裂，使细胞增殖受到抑制。表2 不同浓度苦参碱对H22细胞周期的影响（略）
2.3 苦参碱对荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用
苦参碱处理组小鼠的瘤体体积分别为（10.00±3.8）mm3和（12.19±5.4）mm3，明显小于N.S对照组小鼠瘤体体积（40.04±9.7）mm3，成瘤时间也明显晚于N.S对照组；50 mg/kg和100 mg/kg剂量苦参碱的抑瘤率分别为60.71%和63.53%，明显高于对照组（P<0.01），抑瘤效果接近CTX；高浓度组与低浓度组的抑瘤效果接近，无明显量效差异(P>0.05)，见图1。
2.4 苦参碱对荷瘤小鼠PBMC体外增殖反应的抑制作用
苦参碱单独作用时，明显抑制小鼠静止PBMC的体外增殖，SI小于PBS对照组（P<0.01），对ConA活化了的小鼠PBMC增殖表现出一定的协同刺激作用，但刺激作用随苦参碱浓度的增高而降低，见表3。表3 苦参碱对小鼠PBMC体外增殖活性的影响（略）
2.5 苦参碱对荷瘤小鼠血清中IL�2和IL�12水平的影响
苦参碱治疗后，血清中IL�2和IL�12的水平没有明显改变（P>0.05），提示苦参碱不能促进荷瘤小鼠合成和分泌IL�2和IL�12，见表4。表4 苦参碱对荷瘤小鼠IL�2和IL�12水平的影响（略）
3 讨论
本研究中，我们通过体内外实验观察了苦参碱对小鼠H22肝癌细胞的作用，发现苦参碱作用后H22细胞分裂相减少，胞内颗粒明显增多，大量空泡出现，显示出较强的细胞毒性。苦参碱对H22细胞的增殖抑制作用具有时间和浓度的依赖性，低浓度苦参碱对H22细胞的抑制作用不明显，而0.5 mg/ml及更高浓度的苦参碱则可使细胞数量明显减少，增殖受到明显抑制。此外，苦参碱可使G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，细胞阻滞于G1→S期；细胞增殖指数降低，与细胞增殖抑制试验的结果相一致，表明苦参碱可以影响肿瘤细胞内DNA的复制和合成，抑制细胞的正常分裂；抑制细胞进入S期，从而使细胞在G1期堆积，出现G2/M阻滞，从而抑制细胞的增殖〔8〕。
苦参碱对小鼠H22实体瘤的生长也有明显的抑制作用，抑瘤率达60%以上。实验过程中发现，给以苦参碱治疗的部分小鼠给药后15天始终未形成明显的肿瘤结节，仅在接种处的皮肤表面出现紫红色溃疡性结痂，另有部分小鼠实验初期出现了肉眼可见的皮下肿块，但随着治疗的进行，肿块逐渐缩小至不见；苦参碱治疗后的小鼠，皮下瘤块的出现时间也普遍晚于对照组1～2天, 肿瘤生长速度也明显减慢，表明苦参碱能显著抑制小鼠肿瘤的发生和发展。由于实验中采用的是经腹腔注射的全身给药方式，可以排除苦参碱局部用药产生的毒性作用，表明苦参碱的抑瘤作用是通过机体自身的抗肿瘤机制起作用。
本研究发现，苦参碱不管是对荷瘤小鼠静止PBMC以及ConA活化了的PBMC的体外增殖反应都具有一定的抑制作用，显示了苦参碱在抗肿瘤同时，对免疫功能有一些抑制作用〔9，10〕。抗肿瘤免疫应答反应中，IL�2和IL�12是调节机体细胞免疫功能的两种重要的细胞因子，但本研究结果显示，苦参碱作用前后，小鼠血清中IL�2和IL�12的水平无明显改变，提示苦参碱对小鼠的抗肿瘤细胞免疫应答反应没有明显促进作用〔11〕。
以上研究结果表明，苦参碱对肿瘤所致的小鼠免疫功能低下状态没有明显改善，体内体外实验中都显示出了一定的免疫抑制效应，其抗肿瘤作用主要不是通过提高机体的免疫功能来实现的，还存在有其他的作用机制。
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代表作有：《题西林壁》、《和子由渑池怀旧》、《泗州僧伽塔》、《饮湖上初晴后雨》、《慈湖夹阻风》等。题西林壁
横看成岭侧成峰，远近高低各不同。
不识庐山真面目，只缘身在此山中。
苏轼，字子瞻，又字和仲，号东坡居士，世称苏东坡、苏仙，北宋著名文学家、书法家、画家。
苏轼是宋代文学最高成就的代表，并在诗、词、散文、书、画等方面取得了很高的成就。其诗题材广阔，清新豪健，善用夸张比喻，独具风格，与黄庭坚并称“苏黄”。词开豪放一派，与辛弃疾同是豪放派代表，并称“苏辛”；其散文著述宏富，豪放自如，与欧阳修并称“欧苏”，为“唐宋八大家”之一；苏轼亦善书，为“宋四家”之一；工于画，尤擅墨竹、怪石、枯木等。有《东坡七集》、《东坡易传》、《东坡乐府》等传世。
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