以血凝抑制实验为例来看，在反应系统中，抗原25μL，抗体25μL，加上50μL的红细胞，抗原正好被稀释到原来的1/4浓度，所以用四个单位的抗原相当于在反应系统中抗原的浓度还是1个单位的。
抗原和相应的抗体在动物体内或体外都能发生特异性结合反应，这种反应称为抗原抗体反应，习惯上把体内的抗原抗体反应称为免疫反应，体外的抗原抗体反应称为血清学反应，因为抗体主要存在于血清中。
血清学反应可以用已知的抗体检查未知的抗原，也可用已知抗原测定未知的抗体。人们根据抗体能与相应抗原发生反应并出现可见的抗原—抗体复合物的原理，设计了许多血清学诊断方法，不仅可以检测动物体内乃至体外的病原微生物，或其抗原性成分，而且还可以测定动物机体对病原微生物的侵袭或对其抗原成分的免疫反应。在抗原—抗体复合物成不可见状态时，可以通过琼脂扩散、凝集实验以及酶标记等指示系统，使其变为可见或可测状态。
目前已知的血清学诊断方法很多，现仅介绍几种在目前条件下规模化猪场通过学习都能做到的诊断方法：
（1）凝集试验猪病诊断过程中常用的操作方法有以下几种：
①全血平板凝集试验实践中主要用于细菌性疾病的抗体检测和抗原（经分离培养后）的鉴定。现举例用已知猪丹毒抗原（丹毒杆菌的纯培养液）测定被检猪血清中的抗体。其操作步骤如下：
a.材料猪丹毒凝集抗原，玻片，9号针头，酒精棉球，酒精灯，铂耳（取血环）等。b.操作用铂耳取已知抗原1滴，置于玻片上。用酒精棉球擦拭针头，铂耳在酒精灯上灼烧消毒。用针头刺破被检猪的耳静脉，以铂耳取血与玻片上的抗原等量混合，在2～3分钟内观察结果。c.结果判定出现颗粒状的凝集，为阳性反应。否则为阴性。
②试管凝集试验是一种定量法，用于测定被检血清或其他体液中有否某种抗体及其效价，可做临床的辅助诊断，或用于流行病学监测。在猪场中，本法常用于猪布氏杆菌病的诊断。
A.材料布氏杆菌病试管凝集抗原（1∶20倍稀释），布氏杆菌病阳性血清、阴性血清（1∶25倍稀释），稀释液（0.5 %石炭酸生理盐水），灭菌小试管，1毫升吸管，试管架，待检血清等。B.操作取试管7支置于试管架上，设阳性和阴性血清及抗原对照各1支，测定管4支，以后每增加1个样品，只需增加4支测定管。
按表10示意稀释血清，加抗原，完成后每支试管内应含1毫升液体。
表10 布氏杆菌试管凝集反应（单位：毫升）
试管号 1 2 3 4 5 6 7血清稀释倍数 1∶25 1∶50 1∶100 1∶200 阳性血清对照1∶25 阴性血清对照1∶25 抗原对照0.5%石炭酸生理盐水 1.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5待检血清 0.5 0.5 0.5 0.5 抗原（1∶20稀释） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5弃0.5 弃0.5加入抗原后，将试管充分振荡，置于37℃温箱反应24小时后，判定结果。C.判定标准“-” 液体均匀混浊，管底无凝集物，不凝集。
“+” 液体透明度较差，管底有少量凝集物，为25%凝集。
“++” 液体中等浑浊，管底有中等量的伞状沉淀，50%菌体凝集。
“+++” 液体几乎透明，管底有明显伞状沉淀，75%菌体凝集。
“++++” 液体完全透明，管底出现大片的伞状沉淀，100%菌体凝集。
结果判定：已出现50%菌体凝集的血清最高稀释度为该血清的凝集价。在检测猪布氏杆菌病时，血清凝集价在1∶50以上时，可判为阳性反应。若凝集价为1∶25，则为可凝集（需重复试验1次）。如猪群中基本无阳性反应。则凝集价1∶25也可判为阴性。
③间接红细胞凝集实验（简称间接血凝试验）
该试验能大大提高反应的敏感性。用抗体致敏红细胞检测相应的抗原，称为反向间接血凝试验；反之，称为正向间接血凝实验。在猪病的诊断中，常采用本法对猪口蹄疫、水泡病、猪瘟、传染性胸膜肺炎等疾病抗原的鉴定，或抗体的检测。现举例猪口蹄疫的抗体检测（正向间接血凝），操作步骤如下：
A.目的检测被检血清样品中猪口蹄疫抗体的效价。B.材料猪口蹄疫（O型）正向间接血凝标准致敏红细胞（由兰州兽医研究所提供），标准阳性阴性血清，稀释液，96孔“V”形有机玻璃微量血凝板，微量加样器，滴头，被检血清等。C.操作将待检血清置60℃水浴中灭活30分钟，用微量加样器对血凝板上的每孔加入25微升稀释液，取25微升待检血清加到第一孔，用加样器以吸入与排出的动作混合3～4次，取出25微升放入第二孔混匀，依次到第九孔，取出25微升弃掉。血清稀释度从第一到第九孔分别为1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512（第一排的10～12孔设阳性血清对照、阴性血清对照和抗原对照）。每孔加入25微升致敏红细胞，振荡1～2分钟，置37℃温箱或室1～2小时或更长时间，然后判定结果。D.判定标准“-” 红细胞沉底，呈圆点状，不凝集。
“+” 红细胞大部分集中于中央，周围只有少数凝集，即25%凝集。
“++” 红细胞呈薄层凝集，中心致密，边缘分散，即50%凝集。
“+++” 红细胞凝集程度较上有所增加，即75%凝集。
“++++” 红细胞呈薄层凝集，布满整个孔底或边缘，蜷曲呈荷包蛋边状，即100%凝集。
结果判定：以出现50%凝集（++）的血清最高稀释度，为该血清的间接血凝价。
④血凝（HA）与血凝抑制（HI）试验在猪的传染病中，细小病毒感染、乙型脑炎、伪狂犬病等，适宜进行血凝和血抑试验，本试验以检测猪细小病毒血清抗体为例，介绍如下：
A.材料猪细小病毒浓缩诊断抗原，豚鼠沉积红细胞配成的0.5%悬液。稀释液、标准阳性和阴性血清、被检血清、96孔V形有机玻璃微量血凝板、25～50微升微量移液管、微量振荡器、普通离心机等。B.试验方法a.血凝（HA）试验用滴管在96孔血凝板上以第一孔至试验所需要稀释倍数孔，每孔滴加稀释液25微升，用移液器从第一孔开始依次稀释，置微量振荡器上振荡15秒，最后每孔滴加0.5%豚鼠红细胞25微升，振荡30分钟，置室温（20℃左右）1小时后判定。b.血凝抑制（HI）试验被检猪血清先经56℃、30分钟灭活，然后加入50%豚鼠红细胞（最终浓度）和等量的高岭土，摇匀后放室温15分钟，经2000转/分离心10分钟，取上清液以除掉血清中非特异性的凝集素和抑制素，然后用稀释液将每份处理过的血清1∶5～1∶10至240倍比稀释，在向每孔加入等量4个血凝单位的标准血凝素（抗原），混匀后置室温1小时，加入新配制的0.5%豚鼠红细胞悬液，混匀后置室温2小时，判定结果，同时设阳性、阴性血清及红细胞和抗原的对照，HI抗体滴度≥1∶20者为阳性，猪感染PPV后7天左右可检出HI抗体，12～14天可达1∶1024～5000。
⑤乳胶凝集试验（LAT）
本法在猪病中主要作用于伪狂犬病和猪萎缩性鼻炎的诊断，是用其病毒或细菌致敏乳胶抗原来检测被检猪的血清、全血或乳汁中的抗体，具有简便、快速、特异、敏感的优点。
A.材料伪狂犬病毒致敏乳胶抗原，伪狂犬病阳性血清、阴性血清、稀释液，玻片，吸头，被检血清或全血或乳汁（通常采初乳，经3000转/分钟离心，取上清液做待检样品）。B.试验方法a.定性试验取被测样品（血清，全血或乳汁）、阳性血清、阴性血清、稀释液各1滴，分置于玻片上，各加乳胶抗原1滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1～2分钟，于3～5分钟内观察结果。b.定量试验先将血清在微量反应板或小试管内作连续倍比稀释，各取1滴依次滴加于乳胶凝集反应板上，另设对照（同上），随后各加乳胶抗原1滴。如上搅拌并摇动，然后判定。
C.结果判定首先对照组要出现如下结果，本试验才能成立：阳性血清加抗原呈“++++”，阴性血清加抗原呈“-”，抗原加稀释液呈“-”。
“++++”全部乳胶凝集，颗粒聚集于液滴边缘，液体完全透明。
“+++”大部分乳胶凝集，但颗粒明显，液体稍混浊。
“++”约50%乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊。
“+”仅有少许凝集，液体混浊。
“-”液滴呈原有的均匀乳状。
以出现“++”以上凝集者，判为阳性凝集。
注意事项：试剂盒应在2～8℃冷暗处保存，暂定1年。乳胶抗原为乳白色状液体，如出现分层，使用前轻轻摇匀。
（2）沉淀实验具体方法有多种，如环状沉淀实验、琼脂扩散实验和免疫电泳等。在猪病的诊断中，目前最常用的是琼脂扩散实验，现以检测伪狂犬病的抗体为例，将其操作方法介绍如下：
A.材料伪狂犬病标准抗原，阳性血清，阴性血清，待检血清（56℃灭能30分钟），生理盐水，打孔器，微量移液器，培养皿，琼扩琼脂（配制方法：含有0.1%石炭酸的磷酸缓冲盐水，加入1%的优质琼脂，在沸水中融化均匀，若有杂质，须用纱布过滤，然后分装于盐水瓶内，保存备用）。B.操作a.浇琼脂板和打孔将已融化的琼脂趁热倒入平皿，制成3毫米厚的琼脂板，待凝固后进行打孔。一组共7个孔，中间1孔，孔径4毫米，孔距3毫米。用打孔器打孔，剔出孔内的琼脂然后将琼脂板在酒精灯上来回过2～3次，使琼脂与玻板之间的空隙封闭。b.向孔内加样中央孔加抗原，外周孔第1，5孔加阳性和阴性血清作对照，第2，3，4，6孔加待检血清。将加完样的琼脂平皿加上盖子，置37℃恒温箱扩散24～36个小时，然后判定结果。C.结果判定首先检查标准阳性血清孔和抗原孔之间是否出现明显的致密的白色沉淀线，而阴性孔则不出现，只有在对照组出现正确结果的前提下，被检孔才可参照标准判定。
注意事项：
第一，琼扩所用的琼脂必须是优质的琼脂粉，若用普通的琼脂条，应事先净化精制。精制的简易方法是：取条状琼脂24克，加蒸馏水1000毫升，在沸水中融化，趁热倒入搪瓷盘中，待冷却后切成1平方厘米大小的琼脂块，用蒸馏水或无离子水浸泡2～3天，每天换水4～5次，然后将处理好的琼脂块隔水融化，加入0.1%石炭酸磷酸缓冲盐水，配成1%琼脂。
第二，制备琼脂板应在水平台上进行，防止薄厚不匀。板的厚度要求一致（7.5厘米的平皿，用15毫升琼脂液）。浇制时防止产生气泡。平皿浇制的琼脂板在4℃冰箱内可保存15天。
第三，打孔的孔径、孔距力求准确、合适。
第四，孔中滴加抗原和血清时，孔内必须加满而又不能外溢。加样时不能带进小气泡。
（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）
它是根据抗原与抗体特异性结合的功能，以酶做标记物，利用酶对底物具有高效催化作用的原理而设计的。它既可以用于抗原的诊断，也可进行血清抗体的检测，可达到定性和定量的目的。已广泛地用于传染性疾病的诊断，血清流行病学调查和抗体水平的评价等。
目前在兽医防治的研究和实践中，对于猪瘟、伪狂犬病、繁殖障碍与呼吸综合征、流行性腹泻、旋毛虫病、猪气喘病等疾病，均采用免疫酶技术进行病原诊断、抗体检测和血清学流行性调查，并且已成为规模化猪场化验室工作的一项重要内容。利用免疫酶技术测定抗原和抗体的方法很多，下面简要介绍3种适合猪场使用的免疫酶技术。
①斑点酶联免疫吸附实验（Dot—ELISA）
A.材料硝酸纤维滤膜（孔径0.45微米），0.01摩/升、pH7.2的磷酸盐缓冲盐水，封闭液（磷酸盐缓冲盐水加入10%马血清或0.1%明胶），30%双氧水（H2O2），3，3′-二甲基联苯胺（DAB）抗原液，阴性对照，待检液，待检血清，阳性血清及阴性血清，酶标兔抗猪免疫球蛋白G（IgG），0.05摩/升三羟甲氨基甲烷—盐酸缓冲液，洗涤液（磷酸盐缓冲盐水加入0.05%吐温-20）。B.检测抗原操作第一，硝酸纤维薄膜（NCM）的处理：在滤膜上划6毫米×6毫米的方格，在方格中央用蘸水笔末端压成圆形痕迹。置于蒸馏水中浸泡10分钟，取出后晾干备用。
第二，点样：取1毫升待检液在硝酸纤维滤膜圆圈内点样，同时设立阳性与阴性对照，自然干燥或置于37℃温箱中干燥。
第三，封闭：将硝酸纤维滤膜置于封闭液中，37℃、30分钟，用洗涤液洗涤1次，约3分钟。
第四，加猪阳性血清，将硝酸纤维薄膜置于猪阳性血清中，37℃作用1小时，取出用洗涤液洗涤3次，每次3分钟。
第五，加酶标兔抗猪免疫球蛋白G，37℃作用1小时，然后洗涤3～4次，每次3分钟。
第六，加底物溶液（0.05摩/升三羟甲氨基甲烷—盐酸缓冲液100毫升，加3，3′-二甲基联苯胺40毫克，30%双氧水50微升），作用5～10分钟。
第七，终止显色，将硝酸纤维滤膜置于蒸馏水中冲洗2～3分钟。
第八，自然干燥，或37℃下干燥。
第九，判定标准：
“-” 不呈现斑点，与阴性对照相同。
“+” 斑点较弱或沉淀内有不均质的棕色点。
“++” 斑点浅棕色，对比度清晰。
“+++” 介于++和+++两者之间。
“++++”斑点深棕色，背景白色。
出现阳性反应的血清最高稀释度为该血清的Dot—ELISA效价。
第十，注意事项：试验中的点样抗原、血清及酶标抗体的稀释度，应根据预备试验确定；试验中应使用不溶性供氢体；如3，3′-二甲基联苯胺，4-氯-1-萘酚等，不能使用可溶性供氢体；根据试验的目的要求，确定检测抗原或抗体；封闭液可使用异种动物血清、牛血清蛋白（BSA）或明胶溶液等进行封闭，根据预备试验选择最佳封闭条件。C.检测抗体操作第一，硝酸纤维滤膜的处理，同检测抗原。
第二，点样，取已知抗原液点样，自然晾干或37℃干燥。
第三，封闭，同检测抗原。
第四，将点样后的硝酸纤维滤膜按点样格子剪成小块，置入系列稀释液的待检血清（1∶10，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800）中，同时设立阳性和阴性血清对照，37℃作用1小时，然后用洗涤液洗涤3次，每次3分钟。
第五，以下均同检测抗原第六、第七、第八、第九、第十项操作。
②酶联免疫吸附实验（ELISA）
现介绍猪病诊断常用的两种方法：
A.间接法将已知抗原吸附（或称包被）与固相载体，孵育后洗去未吸附的抗原，随后加入含有特异性抗体的被检血清，感作后洗涤未起反应的物质，加入酶标抗同种球蛋白（如被检血清是猪血清，则需用抗猪球蛋白），感作后再经洗涤，加入酶底物，底物分解后出现颜色变化，颜色变化的速度及程度，与样品中的抗体量有关，即样品中的抗体愈多，颜色出现愈快、愈深。
a.材料0.05摩/升、pH9.6碳酸盐缓冲液，稀释液用0.01摩/升、pH7.2磷酸缓冲盐水（含0.13摩/升氯化钠，0.5%犊牛血清），洗涤液用0.01摩/升、pH7.2磷酸盐缓冲盐水（含0.13摩/升氯化钠，0.05%吐温-20），30%双氧水，邻苯二胺（OPD），pH5.0磷酸二氢钠—柠檬酸缓冲液，2摩/升硫酸，抗原，阳性血清，阴性血清，待检血清，酶标兔抗猪免疫球蛋白，40孔聚苯乙烯联板，酶联免疫检测仪。b.操作第一，用碳酸盐缓冲液配置一定浓度的抗原包被液包被酶联板，每孔100微升，置37℃条件下2小时，或在4℃冰箱内过夜。
第二，倾去孔内液体，用洗涤液加满各孔，洗涤3次，每次3分钟，然后倾尽洗涤液。
第三，除调零孔外，其余孔加入用稀释液稀释的待检血清，每孔100微升，同时设立阳性、阴性血清对照，置37℃下反应1.5小时。
第四，抗体效价测定。将待检血清进行血清进行倍比稀释，每份血清加两排孔，即同一稀释度的血清加上下相邻的两个孔，每孔100微升，凋零孔不加血清。同时设立阳性、阴性血清对照。置37℃反应1.5小时。
第五，洗涤同第二。
第六，除调零孔外，每孔加入酶标记兔抗猪免疫球蛋白G 100微升，置37℃下反应1.5小时。
第七，洗涤同第二。
第八，每孔加入新配置的底物溶液（取邻苯二胺40毫克，溶于100毫升pH5.0的磷酸盐—柠檬酸缓冲液，临用前加入30%双氧水0.15毫升）100微升，室温下观察显色（5～30分钟）。
第九，每孔加入50微升，2摩尔/升硫酸终止反应。
第十，用酶联免疫检测仪测定每孔490纳米波长的光密度（OD）值。
B.夹心法本法是检测抗原的方法，将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体表面，然后加入含有抗原的溶液，使抗原和抗体在固相表面形成复合物，洗除多余的抗原，再加入酶标记的特异性抗体，感作后冲洗，加入酶的底物，颜色的改变与被测样品中的抗原量成正比。
a.材料同间接法。b.操作（以检测猪瘟病毒抗原为例）
第一，抗体包被：将一定溶度的猪瘟高免血清（用碳酸盐缓冲液进行稀释）包被酶联板，每孔100微升，置37℃下反应2小时，或4℃冰箱中过夜。
第二，洗涤：同间接法。
第三，加被检样品，除调零孔外，每份样品加2个孔，每孔加100微升，同时设立阳性抗原、阴性抗原对照，酶结合物对照（抗体加磷酸盐缓冲盐水加酶结合物），置37℃下反应1.5～2小时。
第四，洗涤，同第二。
第五，加底物溶液，同间接法第八。
第六，同间接法第九。
第七，同间接法第十。
C.结果判定常用的判定方法有3种。
阴阳性表示法：待检样本吸收值：规定吸收值≥0.2～0.4为阳性。规定吸收值等于阴性样本平均吸收值加SD（标准差）。
阳性阴性比（P/N）法：样本吸收值/阴性样本平均吸收值≥2～3者为阳性。
终点表示法：以出现阳性反应的样本最高稀释度，为该样本的滴度。D.注意事项第一，包被过程中以高pH和低离子强度的条件为佳，包被浓度在1～100毫克/毫升选择最佳浓度。
第二，血清或抗原稀释液应含5%～10%异种动物血清，或1%牛血清白蛋白，或0.5%明胶，以起封闭作用，防止非特异性反应，否则应在第二与第三步之间加封闭液进行封闭。
第三，洗涤要充分，酶结合物应按照要求进行稀释和使用，底物溶液一定要现配现用。
第四，显色时阴性对照刚出现微黄色时，应立即终止反应。
第五，用阳性阴性比方法判定结果时，阴性对照孔若小于0.1，则易出现误判。
第六，用自动酶联仪检测时，应按仪器规定说明确定调零孔。
第七，同一稀释度2个孔的490纳米波长光密度值的平均值，为该稀释度的光密度值，对照孔应作同样处理。
③猪瘟单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验A.材料本试验的试剂盒由中国兽药监察所提供。本抗原包括猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原和猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原，分别供检测经猪瘟弱毒疫苗免疫后产生的抗体和感染猪瘟强毒后产生的抗体之用。同时提供酶标抗体，阳性、阴性血清，酶联板及其他器材和试剂。B.试验方法第一，用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各做100倍稀释，以100微升分别加入做好标记的酶联板孔中，置湿盒于4℃过夜。
第二，弃去孔内液体，用洗涤液冲洗板3次，每次间隔3～5分钟，拍干。
第三，用稀释液将待检血清作400倍稀释，每孔加入100微升，同时将猪瘟阳性阴性血清以100倍稀释作对照，37℃下培育1.5～2小时。
第四，重复第二步。
第五，用稀释液将兔抗猪免疫球蛋白G辣根过氧化物酶结合物作100倍稀释，每孔加入100微升，37℃下培育1.5～2小时。
第六，重复第二步。
第七，每孔加入底物溶液（每块板所需的底物溶液按邻苯二胺5毫克加底物缓冲液5毫升加30%双氧水18.75微升配制）100微升，室温下观察显色反应（一般阴性对照孔略微显色，立即终止反应，并以阴性孔作空白调零）。
第八，每孔加入终止液50微升，于酶联读书仪上测定490纳米波长的光密度（OD）。C.判定标准a.在猪瘟弱毒酶联板上光密度＞0.2为猪瘟弱毒抗体阳性。
光密度＜0.2为猪瘟弱毒抗体阴性。b.在猪瘟强毒酶联板上光密度≥0.5为猪瘟强毒抗体阳性。
光密度＜0.5为猪瘟强毒抗体阴性。
D.注意事项第一，运输单纯纯化酶联抗原时，必须使用冰盒低温运输。
第二，配制洗涤液时，应使用新鲜蒸馏水或无离子水；每次洗板后，尽量不使孔中有残余液体，以免影响结果。
第三，底物溶液临用前配置，待邻苯二胺完全溶解于底物缓冲液后再加双氧水，混匀后立即加入孔中。
第四，终止反应后，应立即读数。200.猪场兽医检验室应配备哪些器材和试剂？
（1）设备类：猪场兽医检验室配备的主要设备有电冰箱、电热培养箱、电热干燥箱、台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、蒸馏水器、微量血清振荡器、组织捣碎机等。
（2）器械类：猪场兽医检验室配备的主要器械有普通天平、研钵、铁三脚架、酒精灯、石棉网、试管架、接种棒、带盖搪瓷盘、铝饭盒、微量反应板（V型）、微量移液器（100微升、250微升）、普通剪刀、眼科剪刀、眼科镊子、长镊子、手术刀等。
（3）猪场兽医检验室配备的主要玻璃器材：有玻璃注射器、试管、刻度吸管、烧杯、三角烧瓶、玻璃漏斗、量筒、玻璃珠、载玻片、盖玻片等。
（4）试剂类：猪场兽医检验室配备的主要试剂有95%乙醇、氯化钠、氢氧化钠、碱性复红、结晶紫、沙黄、姬姆萨、甲醇、甲醛、草酸铵、甲基红、营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂、三糖铁琼脂、微量生化反应管、二甲苯、显微镜油、擦镜纸、常用猪病血清学诊断试剂盒等。
附录：猪的实用生理常数
第二章 抗体制备技术
抗体的基本概念：多克隆抗体（多个淋巴细胞克隆所分泌的抗体）和单克隆抗体（单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体）
单克隆抗体的特点：
高度均质（同一亚类），化学组成均一，不含或很少含Ig
特异性强，只针对某一种抗原表位
亲和力强
抗原用量少，无须纯化
无批间差异
来源稳定，可达批生产，容易标准化
不易形成沉淀线
操作比较麻烦
什么条件下需要制备单抗：
目的蛋白有类似的结构
抗原不纯，无法分开
多抗的效果不好（已经排除非特异性反应）
希望将抗体用于治疗，研制成药物
希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂。
第一节 多克隆抗体的之别
一、多克隆抗体制备的原理
抗体制备、动物免疫、抗体纯化
二、多抗的基本条件
1. 免疫原的制备
颗粒性抗原：细胞、病毒、细菌等，一般具有较强的免疫原性，可以不加佐剂，直接进行腹腔注射。
可溶性抗原：可溶性抗原的来源主要是天然纯化，或者用目的基因在原核细胞或者真核细胞中表达，可溶性抗原需要与弗氏佐剂完全或不完全混匀，才可以进行免疫。
（1） 完全抗原的提取：细胞破碎法、抗原提取、抗原的纯化
（2）半抗原与载体的交联：载体的选择、半抗原与载体偶联的方法、偶联复合物的鉴定
（3）合成肽抗原：免疫原性肽的选择、肽的合成和纯化
2. 免疫动物的选择：
3. 佐剂的准备：
佐剂的种类：无机佐剂、有机佐剂、合成佐剂、油剂
三、多克隆抗体制备的基本方法
1. 抗原计量、免疫途径与免疫日程
免疫动物的方法：
免疫原值被：
无佐剂免疫法：适用于颗粒性抗原
弗氏佐剂免疫法：适用于可溶性抗原
铝佐剂免疫法：适用于人的免疫
免疫动物（一般选择雌性动物，温顺并且可以生产）
皮内免疫法
皮下或肌肉免疫法
淋巴结免疫法
混合法
抗体效价满意后静脉注射加强免疫
常见的注射方法；皮下注射、皮内注射、尾静脉注射、静脉注射
2. 小样试血与采血
抗血清的获得：眼眶取血、颈动脉放血、心脏采血
免疫效果评价：取血（兔耳动脉、鼠尾静脉）、检测（双向免疫扩散、ELISA）
3. 抗体的分离和纯化技术
盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析、亲和层析法、电泳分离法
亲和层析法原理：利用蛋白质之间的特异性结合（抗原-抗体、受体-配体）将一种配基与凝胶颗粒结合，捕捉与他相配的物质，洗脱另外一种物质，并且洗脱一般用改变pH的方法。
主要步骤：将蛋白质与活化柱子结合，将腹水或者血清处理后过柱子，用结合缓冲液洗柱子（知道A280为零），永安氨酸缓冲液洗脱抗体，等量收集洗脱液，测定洗脱液的A280值，保留A280值明显升高的样品。
4. 抗体的鉴定
蛋白质浓度的测定：紫外分光比色法、双缩脲法、福林酚法、
免疫效果评价：双向免疫扩散、ELISA
纯度分析：免疫印迹（WB）
抗体类别分析：免疫金试条
亲和力分析：ELISA、荧光偏振
5. 抗体的保存
抗体的浓缩：吸收、蒸发、超滤
抗体的保存：浓缩抗议+甘油+防腐剂
免疫效果不佳的原因可能是：抗原纯度不够、免疫原性低、免疫途径乳化不合格、免疫剂量不合适、动物疾病或者种属差异小。
第二节 单克隆抗体制备技术
一、单克隆抗体制备的原理
1个B细胞只能产生1个抗体。方法是细胞工程杂交技术和B细胞杂交瘤技术
需要将单克隆B细胞和肿瘤细胞相结合才可以永久产生单抗
Barski等发现细胞额自然融合现象，但是频率很低
冈田等发现灭火的仙台禀赋和聚乙二醇能显著提高细胞融合的效率。
二、单抗制备的基本条件
需要培养正常的B细胞以及B细胞融合的肿瘤细胞
1. 动物的免疫抗原与载体、动物的选择、免疫途径
举例：小鼠免疫
第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐剂——小鼠背部皮下注射（4周后）
第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐剂——小鼠背部皮下注射（3周后）
第三次免疫：可溶性抗原加生理盐水——小鼠腹腔注射（10天后检测血清效价）
加强免疫：可溶性抗原加生理盐水——小鼠腹腔注射（3天后）
细胞融合
2. 酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养
细胞DNA合成途径：
次黄嘌呤（H）通过嘌呤合成跑路途经合成HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）进一步合成鸟嘌呤核苷酸
胸腺嘧啶核苷（T）通过嘧啶合成旁路途经合成TK（胸腺嘧啶核苷激酶），进一步合成胸腺嘧啶脱氧核苷酸
氨基酸、谷氨酰胺、鸟核苷单磷酸通过核酸生物合成主要途径结合上面两步合成的鸟嘌呤核苷酸以及胸腺嘧啶脱氧核苷酸形成DNA
将第三步当中氨基端变为氨基碟呤（A），则无法形成DNA。
因此酶缺陷型细胞的筛选就是HAT筛选
3. 单抗检测方法的建立
免疫酶技术
免疫荧光技术
免疫扩散技术
三、单抗制备的基本方法
1. 酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养
组织培养的基本条件：
仪器：包括CO2培养箱、倒置显微镜、超净台、液氮罐、低速低温离心机
试剂：培养液、HAT选择培养液、HT培养液、血清、抗生素
耗材：培养板、培养品、吸管、移液管
骨髓瘤细胞系的选择要点：
（1） 所选的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物品系相同
（2） 自身不产生免疫球蛋白的重链和轻链
（3） 对氨基碟呤敏感
（4） 与免疫脾细胞融合后产生稳定分泌的Ig杂交细胞
2. 饲养细胞的制备
饲养细胞的作用：
（1） 增加细胞浓度，满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的要求
（2） 吞噬清楚死亡的细胞
（3） 分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞的生长
饲养细胞的种类和制备方法
（1） 小鼠腹腔巨噬细胞
（2） 小鼠脾细胞
（3） 成纤维细胞
3. 脾细胞的分离
（1） 拉颈椎处死小鼠
（2） 无菌操作取出脾脏
（3） 清洗、研磨
（4） 收集细胞
（5） 离心洗涤
（6） 细胞计数
4. 细胞融合：骨髓瘤细胞和脾细胞按照1:10或1:5的比例混合并加入促融剂PEG
细胞融合的方法：PEG融合、仙台病毒、电融合
5. HAT选择性培养
HAT选择性培养的原理：细胞的DNA生物合成右主要途径和补偿途径。当A存在是，能够阻断DNA合成的主要途径，须通过补偿途径合成DNA，这时就需要HGPRT利用H合成DNA，或者TK利用T合成DNA。
由于选用西黄嘌呤鸟嘌呤荷塘转移酶缺陷型（HPRR-）骨髓瘤在细胞或者胸腺嘧啶割肝激酶缺陷型（TK-）细胞作为亲本，该校只能通过群全条件的DNA培养基才可合成，因此杂种细胞通过互补作用获得HGPPT或者TK基因。只有杂种细胞可以活，酶缺乏性细胞完全无法存活，单克隆B细胞一般不能长期生长，就起到了分离杂交细胞的作用。
细胞生长情况：融合3-4天之后，可以看到刑诉骨髓瘤细胞，混元透亮的克隆。融合后第7-9天去培养上清，检测特异性抗体。
筛选后存活的细胞就是脾细胞和骨髓瘤细胞融合细胞。
6. 阳性克隆的筛选
分泌单克隆抗体杂交瘤细胞的检测方法
免疫酶技术：简介ELISA法
免疫荧光技术：间接免疫荧光测定法、流式细胞分析技术（阴性对照：骨髓瘤细胞培养上清，阳性对照：免疫鼠血清）
7. 克隆化培养：阳性细胞的单克隆化
克隆是指由单个细胞繁殖、扩增而形成的性状均一的细胞集落的过程。
常见方法有：有限稀释法和软琼脂克隆技术
有限稀释法：从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞。
软琼脂克隆技术：从阳性分泌孔中收集杂交瘤细胞，一适当浓度杂交瘤细胞加入到软琼脂培养基中，形成有一个细胞增殖来的细胞集群。
单克隆抗体的鉴定：
（1） 抗体敏感性检测：对腹水和培养基上清进行效价测定
（2） 抗体特异性鉴定：是否与其他抗原右交互反应。
（3） 抗体效价测定
（4） 抗体亚类鉴定：IgG（IgG1、IgG2、IgG3）、IgM
（5） 抗体亲和力鉴定
（6） 识别表位分析
8. 单克隆抗体的扩大生产：细胞培养法、小鼠体内诱生法、生物反应器
细胞培养法：杂交瘤细胞、培养瓶或罐中培养、收集上清液、纯化抗体
动物体内诱生法：Balb/c小鼠、腹腔注射0.5ml液体是啦或降植烷、腹腔内接种杂交瘤细胞、收集腹水
生物反应器：发酵罐培养
单抗培养常见的问题：
（1） 污染：培养环境、操作
（2） 融合细胞不生长：PEG、血清、HAT培养基
（3） 抗体分泌不足：支原体污染、细胞突变、培养体系有问题
（4） 杂交瘤细胞难以克隆化：血清质量、细胞活性
第三节 基因工程抗体制备技术
基因工程抗体：通过基因工程的手段，按照个人意愿进行细胞人工改造的技术。
优点主要有：特异性高、质量稳定、成本低廉、工艺简单、异源性滴低、穿透性好、功能丰富。
一、鼠源抗体人源化
鼠源抗体应用中的障碍：免疫原性、半衰期短、抗体功能片段失活。
1. 嵌合抗体：可变区基因克隆、表达载体的构建、嵌合抗体的表达
2. 改型抗体
二、小分子抗体：Fab抗体、Fv抗体和单链抗体、单域抗体、最小识别单位
小分子抗体的优点：
（1）可在原核体系中表达，降低生产成本。
（2）因为其分子量小，穿透能力强，易进入病灶部位，有利于对肿瘤等疾病的治疗。
（3）不含Fc片段，不与Fc受体结合，可减少因广泛分布的Fc受体而带来的不利影响。
（4）在体内半衰期短，有利于体内毒性物质的消除
（5）易于进一步基因工程分改造。
三、]基于抗体的应用
1. CAR-T免疫治疗：
CAR-T免疫疗法：即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种新型的过继性细胞疗法，即利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞的细胞疗法，并非药物。
CAR-T技术：通过整个嵌合抗原受体的经过基因修饰的T细胞抵抗肿瘤细胞的疗法。嵌合抗原受体可以特异性识别肿瘤相关抗原或者肿瘤特异性抗原，识别结合后将激活及增值信号传递到T细胞内，引起T细胞激活，增殖释放细胞因子，从而杀伤肿瘤细胞。
2. 免疫检查点
3. 免疫毒素
4. ADC
5. 双特异性抗体
第四节 [endif]抗体库技术
抗体库技术：即用基因克隆技术将全套抗体轻重链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体上，通过原核系统直接表达有功能的抗体分子片段，并筛选出特异性的抗体分子和可变区基因。
一、噬菌体展示技术原理：噬菌体展示技术是将外源蛋白质或者DNA序列查到噬菌体外壳上的适当位置，使外源基因随着外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随着噬菌体的重新组装而展现倒是菌体表面的生物技术。到目前为止，人们已经靠发出单链丝状噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统等。
二、噬菌体抗体制备的基本程序
1. 收集淋巴细胞提取mRNA并转录到cDNA或直接提取斯堡基因组的DNA
2. 扩增DNA的抗体可变区基因
3. [构建重组噬菌体库
4. 筛选所需特征的重组噬菌体
5. 采用突变或链置换使亲和力成熟
三、噬菌体抗体技术的特点
1. 筛选步骤简单、快速、有效
2. 扩大了筛选流量，一次就可以筛选多于1010个的克隆
3. 抗体基因型与表现性联系密切，基因稳定且容易改造
4. 模拟天然免疫系统亲和力成熟过程
5. 无需人工接种
6. 可替代动物多克隆抗体
7. 构建康体苦时。轻重链可变区基因在体外随机组合，可产生体内部存在的轻重链组合，得到新的特异性抗体。
8. 可以在预案和系统中表达，大规模生产方便，且成本低。
四、抗体库技术的应用
1. 制备全人源抗体
2. 改良基因工程抗体
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