基因工程中常用的是质粒 有抗性标记基因?

第一个问题：基因工程中常用的是质粒但不一定具有抗性标记基因。

第二个问题：质粒可以没有限制酶切点。

质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了拟核中的DNA外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)（补充：部分质粒为RNA）。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。

目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。

在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对)。

a small cellular inclusion consisting of a ring of DNA that is not in a chromosome but is capable of autonomous replication

目前常用的质粒Strain or plasmida Relevant characteristic(s)b Reference and/or source

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Strains

Brevundimonas sp. strain SD212 2-Hydroxyastaxanthin-producing bacterium 55, MBIC03018

Escherichia coli XL1-Blue MR Host strain of cosmid vector SuperCos 1 Stratagene

E. coli DH5 Host strain for DNA manipulation Toyobo

E. coli JM109 Host strain for heterologous expression of crt genes Toyobo

Plasmids

pACCAR25crtEc Cmr, plasmid carrying crtB, crtI, crtY, crtZ, and crtX 41

pACCAR25crtBc Cmr, plasmid carrying crtE, crtI, crtY, crtZ, and crtX 9

pACCRT-EBc Cmr, plasmid carrying crtE and crtB 31

pACCRT-EIBc Cmr, plasmid carrying crtE, crtB, and crtI 31

pACCAR16crtXc Cmr, plasmid carrying crtE, crtB, crtI, and crtY 31

pACCAR25crtXc Cmr, plasmid carrying crtE, crtB, crtI, crtY, and crtZ 31

pAC-Canthad Cmr, plasmid carrying crtE, crtB, crtI, crtY, and crtW This study

pAC-Astad Cmr, plasmid carrying crtE, crB, crtI, crtY, crtZ, and crtW This study

SuperCos 1 Apr, cosmid vector Stratagene

pBluescript II KS(–) Apr, cloning vector for E. coli Toyobo

pGEM-T Easy Apr, cloning vector for E. coli Promega

pUC18 Apr, cloning vector for E. coli Toyobo

pCos5-2 Apr, 47-kb fragment (partial Sau3AI digest) of strain SD212 inserted into the BamHI site of SuperCos 1 This study

pCRTI-SD212 Apr, 1.1-kb fragment containing crtI amplified by PCR inserted into pGEM-T Easy This study

p5Bre2-15 Apr, 12-kb EcoRI fragment derived from pCos5-2 inserted into pBluescript II KS(–) This study

pUCBre-O11 Apr, 0.77-kb fragment containing ORF11 amplified by PCR derived from p5Bre2-15 inserted into pUC18 This study

目的基因是想要表达的基因，标记基因是有一定特点的基因，例如荧光基因，表达后可表现为抗某种药的基因等。原本受体细胞是不具抗药性的，若导入目的基因后受体细胞表现出抗药性了，则说明目的基因已经成功导入了。

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