细胞的冻存与复苏要注意什么 – 手机爱问

细胞冻存与复苏步骤注意事项

一、原理

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。

细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。

目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

二、操作步骤

（一）冻存

1、消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。

2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。

3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。

4、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。

5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。

7、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。

注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）复苏

1. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射40min以上。

2. 培养液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒温水浴箱370C预热20min，备用。

3. 二甲基亚砜（DMSO)在40C冰箱中冷藏30min，备用。

4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入400C水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化。

5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。

6. 用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度，方培养箱中培养。

7. 记录复苏日期。

【注意事项】

1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。

3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大， 死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液 体前倒净，且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无有异常。

5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

6. 复苏细胞分装的问题：试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响 细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

冻干菌株复苏注意事项：

将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75% 乙醇棉擦净，待干；

无菌操作打开包装；

用无菌吸管将菌种复苏液体培养基约0.3ml左右注入被启开的菌种瓶中并吹打，使瓶中的冻干菌种溶解成菌悬液；

将上述菌悬液吸出，分别接种到非选择性固体斜面或平板如：血平板和菌种复苏培养基中，一般放置在37℃培养箱培养18~24h。对需要特殊培养条件的细菌，如需5%~10%二氧化碳或厌氧条件等，应分别于二氧化碳培养箱或厌氧培养箱中培养；

次日取出培养物，仔细观察菌苔(落)形态、有无杂菌生长、并进行涂片染色镜检，若无异常，转种1~2代后可使用；

如菌种未生长，应继续培养至72h；

如发现培养物生长不良或不纯，可用选择性培养基进行平板分离单个菌落后再传代。不同的细菌对冷冻干燥的抵抗能力不同，弧菌对冷冻干燥的抵抗能力相对较弱，在冷冻干燥过程中菌体细胞容易受伤。因此复苏时应根据其生长特性，选用碱性蛋白胨水(霍乱弧菌)或3%氯化钠碱性蛋白胨水（副溶血性弧菌、创伤弧菌）为复苏培养基，待菌体细胞修复后再接种于适合弧菌生长的非选择性培养基上培养。

先要判断患者意识。大声地呼叫他，或者摇摇他，看是否有反应。凑近他的鼻子、嘴边，感受是否有呼吸。摸摸他的颈动脉，看是否有搏动，切忌不可同时触摸两侧颈动脉，容易发生危险。

开放气道。将患者置于平躺的仰卧位，昏迷的人常常会因舌后坠而造成起到气道堵塞，这时施救人员要跪在患者身体的一侧，一手按住其额头向下压，另一手托起其下巴向上抬，标准是下颌与耳垂的连线垂直于地平线，这样就说明气道已经被打开。

人工呼吸。如患者无呼吸，立即进行口对口人工呼吸两次，然后摸颈动脉，如果能感觉到搏动，那么仅作人工呼吸即可。

方法：最好能找一块干净的纱布或手巾，该在患者的口部，防止细菌感染。施救者一手捏住患者鼻子，大口吸气，屏住，迅速俯身，用嘴包住患者的嘴，快速将气体吹入。与此同时，施救者的眼睛需观察患者的胸廓是否因气体的灌入而扩张，气吹完后，松开捏着鼻子的手，让气体呼出，这样就是完成了一次呼吸过程。每分钟平均完成12次人工呼吸。

胸外心脏按压。如果患者一开始就已经没有脉搏，或者人工呼吸进行一分钟后还是没有触及，则需进行胸外心脏按压。

方法：施救者先要找到按压的部位。沿着最下缘的两侧肋骨从下往身体中间摸到交接点，叫剑突，以剑突为点向上在胸骨上定出两横指的位置，也就是胸骨的中下三分之一交界线处，这里就是实施点。施救者以一手叠放于另一手手背，十指交叉，将掌根部置于刚才找到的位置，依靠上半身的力量垂直向下压，胸骨的下陷距离约为4-5厘米，双手臂必须伸直，不能弯曲，压下后迅速抬起，频率控制在每分钟80-100次。

注意事项：必须控制力道，不可太过用劲，因为力道太大容易引起肋骨骨折，从而造成肋骨刺破心肺肝脾等重要脏器。老人的骨质本身就脆，更要加倍注意。

单人施救和双人施救的比例。单人施救时，每做15次人工呼吸，就做两次胸外心脏按压；双人施救，则是每做10次人工呼吸，就做两次胸外心脏按压。

停止心肺复苏的指证。在施救的同时也要时刻观察患者的生命体征。触摸患者的手足，若温度有所回升，则进一步触摸颈动脉，发现有搏动即可停止心肺复苏，尽快把患者送往医院进行进一步的治疗。

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