qPCR实验的Ct值的合理范围

    Ct值是荧光定量 PCR 最重要的结果呈现形式。它被用于计算 基因 表达量差异或者基因拷贝数。那么荧光定量的Ct值多大可被认为是合理？如何保证Ct值的有效范围呢？

    qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。所谓“一定产物量”后续作进一步解释。

1.指数扩增、模板量与Ct值的关系

    理想情况下，qPCR中的基因经过一定的循环数被指数扩增而积累，扩增循环数和产物量之间的关系是： 扩增产物量=起始模板量×（1+E n ） 循环个数 。然而qPCR反应并不是一直处于理想情况下，当扩增产物量达到“一定产物量”时，此时循环个数为Ct值，处于指数扩增时期。 Ct值与起始模板量的关系 ：模板的Ct值与该模板的 起始拷贝数的对数存在线性关系 。起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。

2.扩增曲线、荧光阈值与一定产物量

    qPCR扩增产物量是以荧光信号的形式直接呈现，也就是扩增曲线。在PCR早期，扩增处于理想情况下，循环数较少，产物积累少，产生荧光的水平不能与荧光本底背景明显地区别，之后荧光的产生增加进入指数期。可以在PCR反应刚处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，以此作为“一定产物量”，并且由此来推断模板最初的含量。因此，一定产物量对应的荧光信号强度，也就是荧光阈值。

在PCR的后期，扩增曲线不再呈现指数扩增，进入线性期和平台期。

3.Ct值的重现性

    PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

1.扩增效率En

    PCR扩增效率是指聚合酶把待扩增基因转变生成扩增子的效率。由1个 DNA 分子转变生成2个DNA分子时的扩增效率为100%。扩增效率常用En表示。为了方便后续文章的分析，简要介绍下影响扩增效率的因素。

2.Ct值的范围

    Ct值的范围为15-35。Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线，扩增效率为100%时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。

对于不同的基因Ct范围，因起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同，需做出该基因的标准曲线，计算出基因的线性检测范围。

3.Ct值的影响因素

    由扩增循环数和产物量之间的关系： 扩增产物量=起始模板量×（1+E n ） 循环个数 ，可以看出，在理想条件下，起始模板量和En会对Ct值产生影响。模板质量或者扩增效率的差异会造成Ct值偏大或过小。

4.Ct值过大或过小

单一的CThu值在没有结合器官背景下没有意义。

CT上各种组织和器官都有不同的HU值，然后不同器官或组织的各种病变也会有不同HU值，只有结合所检查的器官或组织，和器官和组织在CT上的显像，HU值才有意义。

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