凝胶层析操作中应注意的一些具体问题.
(1)层析柱的选择
层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择.一般来讲,主要是层析柱的长度对分辨率影响较大,长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长,否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难.一般柱长度不超过100cm,为得到高分辨率,可以将柱子串联使用.层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间.用于分组分离的凝胶柱,如脱盐柱由于对分辨率要求较低,所以一般比较短.
(2)凝胶柱的鉴定
凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果,关于填装的方法前面已有介绍,这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定.凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡.另外通常可以采用一种有色的物质,如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱,观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度.如果色带狭窄、平整、均匀下降,则表明柱中的凝胶填装情况较好,可以使用；如果色带弥散、歪曲,则需重新装柱.另外值得一提的是,有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附,可以用一些物质预先过柱,以消除吸附.
(3)洗脱液的选择
由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用,它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离,在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用,一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率,改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用,所以和其它层析方法相比,凝胶层析洗脱液的选择不那么严格.由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH 范围较广,所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品,一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析.为了防止凝胶可能有吸附作用,一般洗脱液都含有一定浓度的盐.
(4)加样量
关于加样前面已经有所介绍,要尽量快速、均匀.另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响,加样过多,会造成洗脱峰的重叠,影响分离效果；加样过少,提纯后各组分量少、浓度较低,实验效率低.加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大,当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大,加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－5％左右,而分组分离时加样体积可以较大,一般约为凝胶柱床体积的10％－25％.如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析,根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量.设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2,那么加样量不能超过(Ve1－Ve2).实际由于样品扩散,所以加样量应小于这个值.
从洗脱峰上看,如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开,为了提高效率,可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开,则不能再加大加样量,甚至要减小加样量.另外加样前要注意,样品中的不溶物必须在上样前去掉,以免污染凝胶柱.样品的粘度不能过大,否则会影响分离效果.
梯度洗脱（gradient elution）又称为梯度淋洗或程序洗脱.在同一个分析周期中,按一定程度不断改变流动相的浓度配比,称为梯度洗脱.梯度洗脱的原理：流动相由几种不同极性的溶剂组成,通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性,使每个流出的组分都有合适的容量因子k,并使样品种的所有组分可在最短时间内实现最佳分离.
梯度洗脱特点：提高柱效,改善检测器的灵敏度.当样品中的一个峰的k值和最后一个峰的k值相差几十倍至几百倍时,使用梯度洗脱效果特别好.梯度洗脱中为保证流速的稳定,必须使用恒流泵,否则难获重复结果.梯度洗脱常用一个弱极性的溶剂A和一个强极性的溶剂B.
如：在60min内,流动相配比从甲醇：水=1：99到甲醇：水=100：0
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