1.4.1侵染力测定法
侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上，根据侵染力的大小定量。它的灵敏度在所有定量法中是比较高的，而且是其他定量法的基础。设计一种新的定量法，如果不经过侵染力的验证，将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系统感染率的测定法等。侵染力测定多用粗汁液来接种，为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围，须用缓冲液稀释接种物。
局部枯斑法 1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟（Nicotiana glutinosa）接种叶片上引起局部坏死斑点，在一定的病毒浓度范围内，所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础（田波，1987）。所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法，但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外，还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。
淀粉－碘斑法 当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时，采用此法。Holmes（1931）发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块，但不能用于计数。将这种接种叶用95％乙醇加热到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色时，则侵染点处出现淀粉－碘的蓝色反应。当下午采摘叶片，褪色过夜，然后用碘液染色，则侵染点较周围组织着色浅；当采摘叶片前，植株先在黑暗中放几个小时，再用碘液染色，则侵染点组织着色深。这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物从光合组织中的运出。淀粉－碘染色的强弱受环境条件的影响较大，不如局部枯斑法可靠，但在标准化条件下仍可用于侵染性的定量测定。
侵染性滴度法 当上述方法都不适用时，可采用侵染性滴度法。即把欲测定样品用缓冲液稀释，可用十倍稀释、成倍稀释、半倍稀释或更低稀释。这种方法的缺点是需用大量实验植物，但可得到较好的结果。此方法可用于介体传染的病毒。
随着科学的发展，电镜已成为一种综合的分析仪器，在植物病毒的诊断和鉴定中发挥着重要作用。植物病毒学上用得较多的是透射电镜。
1 透射电镜的成像原理
显微镜的分辨率与其使用光源的波长呈负相关，即波长越短分辨本领越大。可见光的波长范围为0.4～0.7μm，它决定了光镜的分辨极限为0.2μm，有效放大倍数不能超过2000倍。电镜用的光源为电子枪产生的高速电子束，其波长比可见光短十万倍以上，因而大大地提高了分辨率。电镜分辨率接近0.lnm，有效放大倍数在百万倍以上。
在电子显微镜下可观察病毒粒体外形、大小以及在寄主细胞中的位置等。植物病毒粒子常见的有球形、长杆状、线形和弹状。
2 制样技术
样品处理技术多种多样，适用于不同的材料和观察目的。如金属投影和复型技术，主要用于病毒或其他大分子的表面结构和大小观察；冰冻蚀刻用于细胞化学、生物膜等研究；另外还有放射自显影电镜技术、免疫电镜技术等。而植物病毒学上广泛应用的是负染技术和超薄切片技术。负染制样操作简单，所需时间少；而超薄切片制样方法操作复杂，所需时间长，但这种方法可以观察到病毒粒子在组织中的情况。
2.1 负染技术
负染是相对正染而言的。是指在样品的周围包被高电子密度的染料，背景呈深色，而样品呈白色，反衬出样品的轮廓。病毒负染后能很清楚地看到其大小和细微结构。此法简便、易行、快速，为病毒诊断提供了一种可靠手段。现在鉴定病毒，一般先用病汁液做负染观察，根据看到的病毒的大小和形状等，能为进一步研究提供许多有用信息，如采用什么方法提纯、病毒的分类地位如何等。其中有六个病毒属的形态特征非常典型，几乎可以凭此特征就能确定它们属于哪个病毒科、属，见表1。
表1 六个典型特征病毒属
负染的步骤：
制备载膜铜网：在铜网上覆盖一层支持膜，常用0.3%～0.5%福尔瓦（Forvmor）膜（用氯仿配制）。为了加强载膜强度，可以在Forvmor膜上再喷上一层碳膜。
先用载膜铜网吸附样品一至数分钟，病毒浓度低的样品可延长到1h以上，然后去掉多余样品，蒸馏水冲洗数滴去掉部分杂质，然后染色1min左右，去掉多余染料，自然干燥后就可以观察。
注意样品在染色前，尽量不要干燥，否则有些病毒会因干燥而变形或破坏，而醋酸铀等染料能部分固定病毒，减轻干燥对病毒的影响。
在染色和制样中要注意几方面的事项：
（1）取样方法 在负染制样时应该注意寄主特性和病毒在其体内的分布等特性。花叶类型的病株，一般取症状典型的新出叶；而对甜菜黄化病毒组、大麦黄矮病毒组和部分联体病毒组成员，它们都分布在维管束中，维管束的取样和破碎很关键；而线虫传多面体病毒组病毒，植物的各个部位几乎都有分布，种子、分生组织、花粉都可以作为取样的对象。另外寄主种类、发病季节，病株生育期等都能影响实验结果。有些植物体内含有某些特殊的干扰物质，如悬钩子、草莓等植物中含有较高浓度的单宁，木薯、薯蓣叶中含有乳胶，而秋葵、双花扁豆等植物中含有胶质物质，取样时应取它们含量较低的部分，如花器、根等。
（2）适当的抽提方法 有时植株症状很明显，但在电镜下看不到典型的病毒颗粒，这可能是植株体内病毒浓度低，或抽提不充分，或在抽提过程中病毒被降解等原因所致。对浓度低的样品，要加入尽量少的提取液，充分破碎样品，延长抽提时间，加入20%左右氯仿去除色素，低速离心去除大的细胞碎片。有时也可以做一次小样差速离心，浓缩病毒。用PEG沉淀病毒也能起到浓缩病毒作用。对于易破坏的病毒，最好用缓冲液抽提，并加入某些添加剂。常用的有0.01mol/L亚硫酸钠、巯基乙醇、尼古丁等还原剂，蛋白质抑制剂，戊二醛、四氧化锇等固定剂。它们单用或混用。
（3）提纯样品处理 粗提纯或精提纯样品往往含有能和染料起反应的物质，如蔗糖、PEG、PVP、EDTA、氯化铯、硼酸盐、柠檬酸盐等，会产生干扰色，染色前最好用透析等方法除掉它们。
（4）防止样品变形或破坏 病毒在染色和观察中会引起的畸变和破坏，几乎现在已知的染料都能引起某些病毒的破坏作用，如磷钨酸盐对黄瓜花叶病毒属、斐济病毒属、弹状病毒属、等径易变病毒属、联体病毒属、甜菜黄化病毒属的某些成员都具有明显的破坏作用，有时甚至看不到典型的病毒粒体；而醋酸铀则引起一些杆状病毒的变形，如引起大麦条纹花叶病毒扭曲断裂，引起线虫传多面体病毒属一些成员膨胀或崩溃，一向认为很温和的染料钼酸铵也能引起悬钩子丛矮病毒的完全破坏和一些等径易变病毒组成员的部分降解。因此，必须常备多种染料（至少3～4种），采用两种以上染料同时染色同一样品。表2列出了植物病毒染色常用染料。染料最好3～4周更换一次，少量配制（如25ml），冰箱保存，以防氧化失效。
表2 植物病毒染色常用染料
pH调节用1mol/L HCl或1mol/L NaOH，而钼酸铵用醋酸铵调，甲酸铀用氢氧化铵调。
强大电子束的轰击，是造成病毒变形和失去结构细节的另一重要原因，观察时要采用尽量低亮度光斑，动作迅速，以减少轰击时间。Forvmor膜等在电子束照射下，容易漂移，这样病毒会被拉长或拉宽，因此，在测量病毒颗粒大小等精确观察时，最好使用碳膜，或在Forvmor膜上加喷一层碳膜。
（5）病毒粒体大小测量 目前病毒学工作者已经注意到，同一病毒的大小不一样，有些甚至相差甚远。这可能是由于不同分离物或不同株系本身就不同，但大部分可能是由于实验误差或方法上的差别造成的。测量病毒大小，一般不宜提纯病毒，而要用病株粗提液。因为病毒在提纯过程中的形态结构，会由于提纯过程中离子环境等的变化和物理因素的影响发生而变化。染色要用两种以上染料，测量病毒颗粒的数量要尽量多，尤其是线状病毒容易断裂，数量应在100个以上。
2.2 超薄切片技术
根据电镜成像原理可知，用于电镜观察样品其厚度要求在数十纳米，而通常单个细胞的厚度在数十微米，比要求厚度大100倍，而徒手切片或用于光镜的切片机，其切片厚度一般在单个细胞水平，所以电镜观察必须做超薄切片。
超薄切片一般程序为：取材—固定—脱水—包埋—切片—染色—电镜观察。
（1）取材 取材要求典型、迅速，机械损伤小。材料切成1mm3大小，离体后1min之内进入固定液。应取不同寄主材料、同一寄主的不同组织和不同接种时期的样品。
（2）固定 是用物理的或化学的方法迅速将细胞杀死，并且尽可能地使保存和固定细胞内各种结构、生物大分子生活时的状态和位置。电镜中常用的固定方法是化学固定。常用四氧化锇、戊二醛、高锰酸钾或重铬酸钾等固定剂。在病毒学中一般采用2%～3%戊二醛—1%～2%四氧化锇（用0.2mol/LPBS，pH7.2配制）双固定法，这样细胞中的多种成分，如蛋白质、脂类、多糖、核酸等，大部分都能固定下来。戊二醛固定12～24h，四氧化锇固定2～4h。戊二醛遇到锇酸会形成沉淀，因此戊二醛固定后一定要用缓冲液充分清洗后再进行四氧化锇固定。固定在超薄切片中很关键，固定液的种类、浓度、pH、渗透压、离子组成、固定时间、温度和方式都与固定的质量密切相关。因此，整个固定过程应该在4℃下进行。固定剂一定要用缓冲液配制。固定好的材料，电镜下细胞内各种膜系统应该完整，没有断裂，双层膜要基本平行，细胞质呈精细颗粒状，没有空白。固定后缓冲液要充分清洗后再进行下面的步骤。
（3）脱水 常用的包埋剂是疏水的，因此包埋前要用既亲水又亲脂的乙醇或丙酮进行脱水。从低浓度到高浓度的脱水剂脱水，最后用绝对无水的脱水剂脱水。
（4）包埋 包埋的目的是增强样品的机械强度，使样品具有一定的机械形状，适于切片机工作；另一个重要作用是进一步固定细胞结构。包埋剂种类很多，有水溶性的，也有脂溶性的。常用的是Epon812等环氧树脂。包埋过程中发生的化学反应，叫聚合过程。聚合过程中实际上发生了两类反应，一类是环氧树脂末端环氧基之间在胺类化合物（如DMP-30）催化下，化合生成长链；另一类是树脂中间的羟基和交联剂（也称固定剂）的酸酐发生反应，生成横向连桥，加固了树脂分子之间的联系。为了增强树脂聚合形成的包埋块的切割性能，常加入一些增塑剂，如树脂、催化剂、固化剂。
（5）切片 准确、熟练地掌握切片机操作技术，包埋块软硬适度，修块好，就能切出要求质量的片子来。这里技巧很重要。
（6）超薄切片的染色 也叫电镜技术的正染色。观察内容不一样，采用染色方法不同，病毒内含体和细胞病理学研究则常用醋酸双氧铀—柠檬酸铅染色法。切片在1%～2%醋酸双氧铀中染色20min，用50%乙醇冲洗后用柠檬酸铅染色30min，0.01mol/L NaOH冲洗。染色的关键是要防止醋酸铀和柠檬酸铅生成沉淀。防止污染的主要措施是防止CO2和柠檬酸铅反应。如用刚制备出的蒸馏水配制染料和冲洗剂，染色时在小室中进行，小室中放入吸收CO2的固体NaOH，防止人呼吸时CO2进入小室中，戴口罩等。染色和冲洗完毕，切片自然干燥后就可以电镜观察。
电子显微镜的出现及各种电镜技术的发展，为植物病毒的直接观察起到了巨大的推动作用，使检疫工作人员能得到受病毒感染的病毒粒子电镜照片以作为直接证据。但电镜观察结果需要和其他方法的检测结果相结合，才能确定病毒的分类地位。这是因为许多病毒都有类似的形态和结构。由于一些植物汁液中病毒浓度过低，在进行常规的电镜观察检测中，很难发现病毒粒子，这样就要求对一些植物病毒进行分离和提纯，以便进行有效的电镜观察和其他理化检测。病毒的分离和提纯主要是采用差速离心、PEG沉淀的方法，进一步的纯化则采用密度梯度离心和柱层析法。为了直接检测植物体内的带毒情况，常采用植物组织的超薄切片和电镜观察进行。超薄切片的电镜观察可以直接用于对植物组织内部的病毒形态、内含体形态、病毒所在的部位、受感染的植物组织发生的病理学变化等进行检查。
四十个碱基以内， 双链分离， 其中一条连有biotin, 1umol左右末端是氨基
寡核苷酸图谱分析是指核酸或核酸片段经T1核酸酶切割后电泳，少数较大分子量的酶切核酸片段在聚丙烯酰胺凝胶上分布特点的比较。因为它是通过少数核酸片段来了解整个核酸的特征，如同根据指纹特点判断案情一样，因此又称为指纹图分析(Analysis
of fingerprint map)。该法最大优点为比较简便，敏感性高，能显示出核酸间细小的差别，但缺点是无法对差别大的两条来源不同的核酸进行比较。目前该种方法已在病毒学研究中得到了广泛的应用，特别是对RNA病毒分类、鉴定病毒遗传变异等，在流行病学调查中具有重要意义。
(一) 原理 提纯后的病毒核酸，通过适当的酶切，可产生大小不同的片段，经放射性同位素标记(或在病毒培养时标记)后，进行垂直双相电泳，再经放射自显影，可得到特征性的图谱，即寡核苷酸指纹图谱。所用的酶一般是T1核糖核酸酶，这种酶是一种RNA限制酶，特异性地作用于鸟嘌呤核苷酸的3’磷酸基团，切割与其邻近核苷酸相连的5’磷酯键，最终产物为带
3’磷酸鸟嘌呤末端的寡核苷酸，即每断片的3’末端为鸟嘌呤并带有磷酸，而5’末端就暴露出羟基团。然后在T4多核苷酸激酶的作用下，用32P－ATP标记寡核苷酸的5’末端，最后用饱和酚和酵母RNA混合液终止激酶的作用。在pH3.5条件下，从上到下进行第一相电泳，依片段所带电荷的不同将其分开，其后在pH8.2条件下，从右到左进行第二相电泳，可根据片段长短的不同将其分开，通过自显影，便可在底片上看到片段的位置和数目，借此对不同的病毒株的核酸进行分析比较。
在电泳中一般采用两种指示剂：一种为溴酚蓝(BPB)，它的大小相当于8-10个核苷酸，在pH3.5时呈绿色，在pH8.2时呈蓝色；另一种为联苯胺(Xylene
Cyanol，简称XC)，其大小相当于25个核苷酸，在pH3.5时为蓝色，pH8.2时为绿色，它周围的点为重点观察区。由于
12-14个碱基以上的核苷酸片段特异性高，太短的片段特异性低，因此，图谱上部的斑点由于片段较小难以进行分析，多取图谱下端或整个图的下1/3处斑点进行比较，一般取50-70个斑点。
(二) 基本方法
1.病毒的增殖与核酸的提纯 用适当的组织培养细胞繁殖病毒，有些病毒也可用鸡胚进行繁殖，以饱和酚法提纯病毒核酸。
2.核糖核酸酶切和同位素标记 常用的酶是T1核糖核酸酶(故该技术又称为T1－寡核苷酸指纹图谱)，将该酶与病毒
RNA以一定比例混合，置37℃消化30-40分钟。经消化后的核酸变为大小不等的片段，片段的大小与鸟苷酸的含量有关。消化步骤为：于Eppendorf管中加入1?l去离子水，加1?g病毒RNA，加1?l
2倍浓缩的消化缓冲液( 40m mol/L pH7.5 Tris-HCl，2m
mol/L EDTA )，置沸水中煮60-90秒，快速置冰浴中冷却，加入2?l
T1酶(5IU/?l)，混合后置37℃水浴30-40分钟。
标记的方法有两种：一是内标记，即在病毒培养液中加入32P－正磷酸盐或32P－ATP，使增殖的病毒中带有32P。另一种方法是外标记(又称末端标记)，在经过消化后的核酸片段中加入32P-ATP和T4多核苷酸激酶，以标记片段5’端。外标记方法为：于上述酶消化溶液中加入35?l激酶缓冲液(10m
mol/ LTris－HCl，10m mol/ L Mg(OAC)2，1m
mol/L DTT)，1?l T4多核苷酸激酶，10?l32P-ATP(比活性5000Ci/m
mol)，混合后置37℃水浴30分钟。
3.反应终止及寡核苷酸的提取 于上述反应物中加入100?l
TSE饱和酚，混合，再加入中止混合物(用0.6mol/L醋酸氨配成2mg/ml的酵母RNA)终止激酶作用。
pH7.8的TSE缓冲液：
Tris 2.42g 最终浓度0.02mol/L
NaCl 8.77g 最终浓度0.15mol/L
EDTA(Na2) 0.74g 最终浓度0.002mol/L
用1N HCl(约12ml)调pH至7.8，补无离子水至1
000ml，高压消毒。
将上述终止后的溶液，轻摇混合后，11 000r/min离心3分钟，取上层水相，加入2.5倍冷无水乙醇，混合置-20℃过夜或-70℃30分钟，用12
000r/min离心15分钟，弃上清，干燥沉淀物(即核酸)。
4.电泳及自显影
指示染料的配制：以10ml为例
溴酚兰 10mg 终浓度：0.1％
联苯胺 10mg 0.1％
尿 素 3.6g 6mol/L
蔗 糖 1g 10％(W/V)
EDTA 2mg 50m mol/L
酵母RNA 100mg 10mg/ml
加无离子水至10ml
(1) 第Ⅰ相电泳 将玻璃板(20×39cm)及梳子清洗干净，用10％丙烯酰胺，0.325％甲叉双丙烯酰胺注胶，电泳缓冲液为25mmol/L柠檬酸，6mol/L尿素，pH3.5。待凝胶凝聚后，进行垂直式电泳，方向为从上到下，在4℃预电泳30-60分钟后，将制备好的干燥核酸片段加20?l指示染料溶解混匀点样，电泳至溴酚蓝泳动20cm时停止电泳。此时可取下凝胶的一块玻璃板，用玻璃纸将胶包住、胶面朝上，于暗室中将X光底片放在胶面的玻璃纸上，在
X光底片上放一块比底片稍大的增强板，将另一块玻璃擦洗干净盖在增强板上，用黑纸包好以免透光，置4℃自显影1-2小时，然后于暗室取出底片冲洗，冲洗后底片上应见到从小到大的糖葫芦状黑点。
(2) 第Ⅱ相电泳 将Ⅰ相的底片，根据所作记号与Ⅰ相凝胶对齐，沿着点的两边切出约
1cm宽的长条，长条长约20cm(从指示剂XC上端8cm，至下端12cm)，切下的胶条放在准备好的玻璃板上，摆直放平，用滤纸将胶条残余水吸干，摆好间条，放上另一准备好的玻璃板，固定两层玻板后即可灌胶。凝胶浓度为21.8％丙烯酰胺，0.8％甲叉双丙烯酰胺，电泳缓冲液为0.1mol/L
Tris－硼酸，2.5mmol/L EDTA，pH8.3。凝胶聚合后直接在室温下进行电泳，泳动方向为由Ⅰ相胶条端向另一端泳动，当溴酚蓝运行20cm时，停止电泳。取下凝胶进行自显影，方法与第Ⅰ相显影相同，显影时间取决于同位素强度和实验目的。最好使用分辨率较高的核子乳胶片。
(三) 结果分析 在Ⅱ相胶自显影前先观察XC和BPB两个指示剂的距离(应与Ⅰ相胶条中一样)。如距离太小，有的点可能重叠，增长了，有的点可能从胶两旁跑掉。XC标记周围约50－70个点为重点比较区，而BPB周围点一般仅作参考。为证实某一或某数点是否是某毒株核酸独有的，须进行混合电泳。即将两个毒株的32P－ATP标记核酸等量混合，与非混合样品同时进行电泳，进行比较，如某一点为两毒株共有的，就在相应位置上出现一个点，否则出现两个点。
两个或两个以上毒株比较时，常以其中一株为标准株，其余的为比较株。凡标准株寡核苷酸图中出现的点，而其他毒株没有，表示片段丢失；凡标准株没有的点，而其他毒株出现了，表示片段增加。最后统计出共增加了多少点，丢失了多少点。因此根据两个毒株的图谱中点的相似情况以及斑点消失和增加数目，可推测两毒株核酸的同源性。从理论上讲，点丢失的最高数与增加数是对等的，即大片段点增加是由小片段点改变而来。将丢失和增加点数相加除以2，乘以系数1.5(根据统计学假定，这种成对改变50％是由于单一点改变而来，50％可能是各自突变而来)，加上不成对的点数即成对后剩下的数，用以表示毒株的大致关系，如一个毒株与另一毒株相比时，丢失6个点，增加了4个点，那么它们之间鸟嘌呤碱基改变的最少数应为，4×1.5＋2＝8。
(四) 应用 形态学和血清学的方法可用于鉴定病毒的血清型，在某些情况下可鉴定病毒亚型，但不能区别同一血清型或亚型的不同病毒株和分离物，而寡核苷酸指纹图谱技术可以进一步区别它们，这对在自然条件下容易变异的病毒是很有价值的。
Kusters，J.G.等对12株分离自荷兰的传染性支气管炎病毒进行寡核苷酸指纹图谱分析，结果将它们分为两组，并提出第一组中的3个分离株V1259
、V1385 、V1397是疫苗株H52和H120的突变株。70年代后期分离的6株在血清型上和基因型上都与疫苗株(H52和H120
)无关，说明是自然突变株。Clewley等对分离的13株传染性支气管炎病毒进行研究，泳出了11种不同的寡核苷酸指纹图谱。不同血清型的毒株，图谱明显不同，而同一血清型的不同毒株，指纹图谱也有差异，并发现某些分离物是疫苗株的突变种。Karaca等对3株分离自肠道的传染性支气管炎病毒进行研究后认为，尽管这3株毒株是从3个不同鸡群分离出的，但它们的寡核苷酸指纹图谱却几乎相同，且与Conn－46株的指纹图谱很相似，故此认为这3株病毒是由Connecticut毒株的基因突变而来的，并且推测是决定血清型的S1蛋白基因突变所致。Hori等用该技术分析了1935－1984年从日本和泰国分离的12株日本脑炎病毒的核酸基因组。结果表明，所有的日本毒株都有某些共同的斑点，并且在相近的年份分离的毒株相似率更高。在同一年份、同一地区分离的毒株则极为相似。并发现在这两个地理位置上相隔较远的国家，日本脑炎病毒经历了各自不同的基因突变和选择过程。Rekik等对8株分离的禽呼肠孤病毒和1株S1133疫苗株进行寡核苷酸指纹图谱分析，结果表明，分离株之间基因组同源性较强，其中5株与疫苗株的图谱非常相似，但可以明显地区别开。从而可检查出自然界呼肠孤病毒基因组的变异情况和监测其进化程度。郭元吉等从我国猪群中分离到1株丙型流感病毒，用寡核苷酸指纹图谱分析证明，该株病毒可能是在我国猪群中存在的一种新的丙型流感病毒；也可能是由以前的毒株演变而来。白植生等用该技术检查16株1977－1980年的甲3
型流感病毒，结果表明，这些毒株的基因组很相似，并证实1977年毒株是1979－1980年毒株的前身，RNA基因组碱基变异频率大约为每年0.4％－0.6％。
除上述病毒外，该技术还应用于口蹄疫病毒，蓝舌病毒、脊髓灰质炎病毒、禽反转录病毒、马脑脊髓炎病毒、水泡性口炎病毒、轮状病毒等的研究。其分析结果有时被仲裁机构作为处理经济纠纷的依据。
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