猪病常用的血清学诊断方法有哪些？

抗原和相应的抗体在动物体内或体外都能发生特异性结合反应，这种反应称为抗原抗体反应，习惯上把体内的抗原抗体反应称为免疫反应，体外的抗原抗体反应称为血清学反应，因为抗体主要存在于血清中。

血清学反应可以用已知的抗体检查未知的抗原，也可用已知抗原测定未知的抗体。人们根据抗体能与相应抗原发生反应并出现可见的抗原—抗体复合物的原理，设计了许多血清学诊断方法，不仅可以检测动物体内乃至体外的病原微生物，或其抗原性成分，而且还可以测定动物机体对病原微生物的侵袭或对其抗原成分的免疫反应。在抗原—抗体复合物成不可见状态时，可以通过琼脂扩散、凝集实验以及酶标记等指示系统，使其变为可见或可测状态。

目前已知的血清学诊断方法很多，现仅介绍几种在目前条件下规模化猪场通过学习都能做到的诊断方法：

（1）凝集试验猪病诊断过程中常用的操作方法有以下几种：

①全血平板凝集试验实践中主要用于细菌性疾病的抗体检测和抗原（经分离培养后）的鉴定。现举例用已知猪丹毒抗原（丹毒杆菌的纯培养液）测定被检猪血清中的抗体。其操作步骤如下：

a.材料猪丹毒凝集抗原，玻片，9号针头，酒精棉球，酒精灯，铂耳（取血环）等。b.操作用铂耳取已知抗原1滴，置于玻片上。用酒精棉球擦拭针头，铂耳在酒精灯上灼烧消毒。用针头刺破被检猪的耳静脉，以铂耳取血与玻片上的抗原等量混合，在2～3分钟内观察结果。c.结果判定出现颗粒状的凝集，为阳性反应。否则为阴性。

②试管凝集试验是一种定量法，用于测定被检血清或其他体液中有否某种抗体及其效价，可做临床的辅助诊断，或用于流行病学监测。在猪场中，本法常用于猪布氏杆菌病的诊断。

A.材料布氏杆菌病试管凝集抗原（1∶20倍稀释），布氏杆菌病阳性血清、阴性血清（1∶25倍稀释），稀释液（0.5 %石炭酸生理盐水），灭菌小试管，1毫升吸管，试管架，待检血清等。B.操作取试管7支置于试管架上，设阳性和阴性血清及抗原对照各1支，测定管4支，以后每增加1个样品，只需增加4支测定管。

按表10示意稀释血清，加抗原，完成后每支试管内应含1毫升液体。

表10 布氏杆菌试管凝集反应（单位：毫升）

试管号 1 2 3 4 5 6 7血清稀释倍数 1∶25 1∶50 1∶100 1∶200 阳性血清对照1∶25 阴性血清对照1∶25 抗原对照0.5%石炭酸生理盐水 1.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5待检血清 0.5 0.5 0.5 0.5 抗原（1∶20稀释） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5弃0.5 弃0.5加入抗原后，将试管充分振荡，置于37℃温箱反应24小时后，判定结果。C.判定标准“-” 液体均匀混浊，管底无凝集物，不凝集。

“+” 液体透明度较差，管底有少量凝集物，为25%凝集。

“++” 液体中等浑浊，管底有中等量的伞状沉淀，50%菌体凝集。

“+++” 液体几乎透明，管底有明显伞状沉淀，75%菌体凝集。

“++++” 液体完全透明，管底出现大片的伞状沉淀，100%菌体凝集。

结果判定：已出现50%菌体凝集的血清最高稀释度为该血清的凝集价。在检测猪布氏杆菌病时，血清凝集价在1∶50以上时，可判为阳性反应。若凝集价为1∶25，则为可凝集（需重复试验1次）。如猪群中基本无阳性反应。则凝集价1∶25也可判为阴性。

③间接红细胞凝集实验（简称间接血凝试验）

该试验能大大提高反应的敏感性。用抗体致敏红细胞检测相应的抗原，称为反向间接血凝试验；反之，称为正向间接血凝实验。在猪病的诊断中，常采用本法对猪口蹄疫、水泡病、猪瘟、传染性胸膜肺炎等疾病抗原的鉴定，或抗体的检测。现举例猪口蹄疫的抗体检测（正向间接血凝），操作步骤如下：

A.目的检测被检血清样品中猪口蹄疫抗体的效价。B.材料猪口蹄疫（O型）正向间接血凝标准致敏红细胞（由兰州兽医研究所提供），标准阳性阴性血清，稀释液，96孔“V”形有机玻璃微量血凝板，微量加样器，滴头，被检血清等。C.操作将待检血清置60℃水浴中灭活30分钟，用微量加样器对血凝板上的每孔加入25微升稀释液，取25微升待检血清加到第一孔，用加样器以吸入与排出的动作混合3～4次，取出25微升放入第二孔混匀，依次到第九孔，取出25微升弃掉。血清稀释度从第一到第九孔分别为1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512（第一排的10～12孔设阳性血清对照、阴性血清对照和抗原对照）。每孔加入25微升致敏红细胞，振荡1～2分钟，置37℃温箱或室1～2小时或更长时间，然后判定结果。D.判定标准“-” 红细胞沉底，呈圆点状，不凝集。

“+” 红细胞大部分集中于中央，周围只有少数凝集，即25%凝集。

“++” 红细胞呈薄层凝集，中心致密，边缘分散，即50%凝集。

“+++” 红细胞凝集程度较上有所增加，即75%凝集。

“++++” 红细胞呈薄层凝集，布满整个孔底或边缘，蜷曲呈荷包蛋边状，即100%凝集。

结果判定：以出现50%凝集（++）的血清最高稀释度，为该血清的间接血凝价。

④血凝（HA）与血凝抑制（HI）试验在猪的传染病中，细小病毒感染、乙型脑炎、伪狂犬病等，适宜进行血凝和血抑试验，本试验以检测猪细小病毒血清抗体为例，介绍如下：

A.材料猪细小病毒浓缩诊断抗原，豚鼠沉积红细胞配成的0.5%悬液。稀释液、标准阳性和阴性血清、被检血清、96孔V形有机玻璃微量血凝板、25～50微升微量移液管、微量振荡器、普通离心机等。B.试验方法a.血凝（HA）试验用滴管在96孔血凝板上以第一孔至试验所需要稀释倍数孔，每孔滴加稀释液25微升，用移液器从第一孔开始依次稀释，置微量振荡器上振荡15秒，最后每孔滴加0.5%豚鼠红细胞25微升，振荡30分钟，置室温（20℃左右）1小时后判定。b.血凝抑制（HI）试验被检猪血清先经56℃、30分钟灭活，然后加入50%豚鼠红细胞（最终浓度）和等量的高岭土，摇匀后放室温15分钟，经2000转/分离心10分钟，取上清液以除掉血清中非特异性的凝集素和抑制素，然后用稀释液将每份处理过的血清1∶5～1∶10至240倍比稀释，在向每孔加入等量4个血凝单位的标准血凝素（抗原），混匀后置室温1小时，加入新配制的0.5%豚鼠红细胞悬液，混匀后置室温2小时，判定结果，同时设阳性、阴性血清及红细胞和抗原的对照，HI抗体滴度≥1∶20者为阳性，猪感染PPV后7天左右可检出HI抗体，12～14天可达1∶1024～5000。

⑤乳胶凝集试验（LAT）

本法在猪病中主要作用于伪狂犬病和猪萎缩性鼻炎的诊断，是用其病毒或细菌致敏乳胶抗原来检测被检猪的血清、全血或乳汁中的抗体，具有简便、快速、特异、敏感的优点。

A.材料伪狂犬病毒致敏乳胶抗原，伪狂犬病阳性血清、阴性血清、稀释液，玻片，吸头，被检血清或全血或乳汁（通常采初乳，经3000转/分钟离心，取上清液做待检样品）。B.试验方法a.定性试验取被测样品（血清，全血或乳汁）、阳性血清、阴性血清、稀释液各1滴，分置于玻片上，各加乳胶抗原1滴，用牙签混匀，搅拌并摇动1～2分钟，于3～5分钟内观察结果。b.定量试验先将血清在微量反应板或小试管内作连续倍比稀释，各取1滴依次滴加于乳胶凝集反应板上，另设对照（同上），随后各加乳胶抗原1滴。如上搅拌并摇动，然后判定。

C.结果判定首先对照组要出现如下结果，本试验才能成立：阳性血清加抗原呈“++++”，阴性血清加抗原呈“-”，抗原加稀释液呈“-”。

“++++”全部乳胶凝集，颗粒聚集于液滴边缘，液体完全透明。

“+++”大部分乳胶凝集，但颗粒明显，液体稍混浊。

“++”约50%乳胶凝集，但颗粒较细，液体较混浊。

“+”仅有少许凝集，液体混浊。

“-”液滴呈原有的均匀乳状。

以出现“++”以上凝集者，判为阳性凝集。

注意事项：试剂盒应在2～8℃冷暗处保存，暂定1年。乳胶抗原为乳白色状液体，如出现分层，使用前轻轻摇匀。

（2）沉淀实验具体方法有多种，如环状沉淀实验、琼脂扩散实验和免疫电泳等。在猪病的诊断中，目前最常用的是琼脂扩散实验，现以检测伪狂犬病的抗体为例，将其操作方法介绍如下：

A.材料伪狂犬病标准抗原，阳性血清，阴性血清，待检血清（56℃灭能30分钟），生理盐水，打孔器，微量移液器，培养皿，琼扩琼脂（配制方法：含有0.1%石炭酸的磷酸缓冲盐水，加入1%的优质琼脂，在沸水中融化均匀，若有杂质，须用纱布过滤，然后分装于盐水瓶内，保存备用）。B.操作a.浇琼脂板和打孔将已融化的琼脂趁热倒入平皿，制成3毫米厚的琼脂板，待凝固后进行打孔。一组共7个孔，中间1孔，孔径4毫米，孔距3毫米。用打孔器打孔，剔出孔内的琼脂然后将琼脂板在酒精灯上来回过2～3次，使琼脂与玻板之间的空隙封闭。b.向孔内加样中央孔加抗原，外周孔第1，5孔加阳性和阴性血清作对照，第2，3，4，6孔加待检血清。将加完样的琼脂平皿加上盖子，置37℃恒温箱扩散24～36个小时，然后判定结果。C.结果判定首先检查标准阳性血清孔和抗原孔之间是否出现明显的致密的白色沉淀线，而阴性孔则不出现，只有在对照组出现正确结果的前提下，被检孔才可参照标准判定。

注意事项：

第一，琼扩所用的琼脂必须是优质的琼脂粉，若用普通的琼脂条，应事先净化精制。精制的简易方法是：取条状琼脂24克，加蒸馏水1000毫升，在沸水中融化，趁热倒入搪瓷盘中，待冷却后切成1平方厘米大小的琼脂块，用蒸馏水或无离子水浸泡2～3天，每天换水4～5次，然后将处理好的琼脂块隔水融化，加入0.1%石炭酸磷酸缓冲盐水，配成1%琼脂。

第二，制备琼脂板应在水平台上进行，防止薄厚不匀。板的厚度要求一致（7.5厘米的平皿，用15毫升琼脂液）。浇制时防止产生气泡。平皿浇制的琼脂板在4℃冰箱内可保存15天。

第三，打孔的孔径、孔距力求准确、合适。

第四，孔中滴加抗原和血清时，孔内必须加满而又不能外溢。加样时不能带进小气泡。

（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）

它是根据抗原与抗体特异性结合的功能，以酶做标记物，利用酶对底物具有高效催化作用的原理而设计的。它既可以用于抗原的诊断，也可进行血清抗体的检测，可达到定性和定量的目的。已广泛地用于传染性疾病的诊断，血清流行病学调查和抗体水平的评价等。

目前在兽医防治的研究和实践中，对于猪瘟、伪狂犬病、繁殖障碍与呼吸综合征、流行性腹泻、旋毛虫病、猪气喘病等疾病，均采用免疫酶技术进行病原诊断、抗体检测和血清学流行性调查，并且已成为规模化猪场化验室工作的一项重要内容。利用免疫酶技术测定抗原和抗体的方法很多，下面简要介绍3种适合猪场使用的免疫酶技术。

①斑点酶联免疫吸附实验（Dot—ELISA）

A.材料硝酸纤维滤膜（孔径0.45微米），0.01摩/升、pH7.2的磷酸盐缓冲盐水，封闭液（磷酸盐缓冲盐水加入10%马血清或0.1%明胶），30%双氧水（H2O2），3，3′-二甲基联苯胺（DAB）抗原液，阴性对照，待检液，待检血清，阳性血清及阴性血清，酶标兔抗猪免疫球蛋白G（IgG），0.05摩/升三羟甲氨基甲烷—盐酸缓冲液，洗涤液（磷酸盐缓冲盐水加入0.05%吐温-20）。B.检测抗原操作第一，硝酸纤维薄膜（NCM）的处理：在滤膜上划6毫米×6毫米的方格，在方格中央用蘸水笔末端压成圆形痕迹。置于蒸馏水中浸泡10分钟，取出后晾干备用。

第二，点样：取1毫升待检液在硝酸纤维滤膜圆圈内点样，同时设立阳性与阴性对照，自然干燥或置于37℃温箱中干燥。

第三，封闭：将硝酸纤维滤膜置于封闭液中，37℃、30分钟，用洗涤液洗涤1次，约3分钟。

第四，加猪阳性血清，将硝酸纤维薄膜置于猪阳性血清中，37℃作用1小时，取出用洗涤液洗涤3次，每次3分钟。

第五，加酶标兔抗猪免疫球蛋白G，37℃作用1小时，然后洗涤3～4次，每次3分钟。

第六，加底物溶液（0.05摩/升三羟甲氨基甲烷—盐酸缓冲液100毫升，加3，3′-二甲基联苯胺40毫克，30%双氧水50微升），作用5～10分钟。

第七，终止显色，将硝酸纤维滤膜置于蒸馏水中冲洗2～3分钟。

第八，自然干燥，或37℃下干燥。

第九，判定标准：

“-” 不呈现斑点，与阴性对照相同。

“+” 斑点较弱或沉淀内有不均质的棕色点。

“++” 斑点浅棕色，对比度清晰。

“+++” 介于++和+++两者之间。

“++++”斑点深棕色，背景白色。

出现阳性反应的血清最高稀释度为该血清的Dot—ELISA效价。

第十，注意事项：试验中的点样抗原、血清及酶标抗体的稀释度，应根据预备试验确定；试验中应使用不溶性供氢体；如3，3′-二甲基联苯胺，4-氯-1-萘酚等，不能使用可溶性供氢体；根据试验的目的要求，确定检测抗原或抗体；封闭液可使用异种动物血清、牛血清蛋白（BSA）或明胶溶液等进行封闭，根据预备试验选择最佳封闭条件。C.检测抗体操作第一，硝酸纤维滤膜的处理，同检测抗原。

第二，点样，取已知抗原液点样，自然晾干或37℃干燥。

第三，封闭，同检测抗原。

第四，将点样后的硝酸纤维滤膜按点样格子剪成小块，置入系列稀释液的待检血清（1∶10，1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800）中，同时设立阳性和阴性血清对照，37℃作用1小时，然后用洗涤液洗涤3次，每次3分钟。

第五，以下均同检测抗原第六、第七、第八、第九、第十项操作。

②酶联免疫吸附实验（ELISA）

现介绍猪病诊断常用的两种方法：

A.间接法将已知抗原吸附（或称包被）与固相载体，孵育后洗去未吸附的抗原，随后加入含有特异性抗体的被检血清，感作后洗涤未起反应的物质，加入酶标抗同种球蛋白（如被检血清是猪血清，则需用抗猪球蛋白），感作后再经洗涤，加入酶底物，底物分解后出现颜色变化，颜色变化的速度及程度，与样品中的抗体量有关，即样品中的抗体愈多，颜色出现愈快、愈深。

a.材料0.05摩/升、pH9.6碳酸盐缓冲液，稀释液用0.01摩/升、pH7.2磷酸缓冲盐水（含0.13摩/升氯化钠，0.5%犊牛血清），洗涤液用0.01摩/升、pH7.2磷酸盐缓冲盐水（含0.13摩/升氯化钠，0.05%吐温-20），30%双氧水，邻苯二胺（OPD），pH5.0磷酸二氢钠—柠檬酸缓冲液，2摩/升硫酸，抗原，阳性血清，阴性血清，待检血清，酶标兔抗猪免疫球蛋白，40孔聚苯乙烯联板，酶联免疫检测仪。b.操作第一，用碳酸盐缓冲液配置一定浓度的抗原包被液包被酶联板，每孔100微升，置37℃条件下2小时，或在4℃冰箱内过夜。

第二，倾去孔内液体，用洗涤液加满各孔，洗涤3次，每次3分钟，然后倾尽洗涤液。

第三，除调零孔外，其余孔加入用稀释液稀释的待检血清，每孔100微升，同时设立阳性、阴性血清对照，置37℃下反应1.5小时。

第四，抗体效价测定。将待检血清进行血清进行倍比稀释，每份血清加两排孔，即同一稀释度的血清加上下相邻的两个孔，每孔100微升，凋零孔不加血清。同时设立阳性、阴性血清对照。置37℃反应1.5小时。

第五，洗涤同第二。

第六，除调零孔外，每孔加入酶标记兔抗猪免疫球蛋白G 100微升，置37℃下反应1.5小时。

第七，洗涤同第二。

第八，每孔加入新配置的底物溶液（取邻苯二胺40毫克，溶于100毫升pH5.0的磷酸盐—柠檬酸缓冲液，临用前加入30%双氧水0.15毫升）100微升，室温下观察显色（5～30分钟）。

第九，每孔加入50微升，2摩尔/升硫酸终止反应。

第十，用酶联免疫检测仪测定每孔490纳米波长的光密度（OD）值。

B.夹心法本法是检测抗原的方法，将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体表面，然后加入含有抗原的溶液，使抗原和抗体在固相表面形成复合物，洗除多余的抗原，再加入酶标记的特异性抗体，感作后冲洗，加入酶的底物，颜色的改变与被测样品中的抗原量成正比。

a.材料同间接法。b.操作（以检测猪瘟病毒抗原为例）

第一，抗体包被：将一定溶度的猪瘟高免血清（用碳酸盐缓冲液进行稀释）包被酶联板，每孔100微升，置37℃下反应2小时，或4℃冰箱中过夜。

第二，洗涤：同间接法。

第三，加被检样品，除调零孔外，每份样品加2个孔，每孔加100微升，同时设立阳性抗原、阴性抗原对照，酶结合物对照（抗体加磷酸盐缓冲盐水加酶结合物），置37℃下反应1.5～2小时。

第四，洗涤，同第二。

第五，加底物溶液，同间接法第八。

第六，同间接法第九。

第七，同间接法第十。

C.结果判定常用的判定方法有3种。

阴阳性表示法：待检样本吸收值：规定吸收值≥0.2～0.4为阳性。规定吸收值等于阴性样本平均吸收值加SD（标准差）。

阳性阴性比（P/N）法：样本吸收值/阴性样本平均吸收值≥2～3者为阳性。

终点表示法：以出现阳性反应的样本最高稀释度，为该样本的滴度。D.注意事项第一，包被过程中以高pH和低离子强度的条件为佳，包被浓度在1～100毫克/毫升选择最佳浓度。

第二，血清或抗原稀释液应含5%～10%异种动物血清，或1%牛血清白蛋白，或0.5%明胶，以起封闭作用，防止非特异性反应，否则应在第二与第三步之间加封闭液进行封闭。

第三，洗涤要充分，酶结合物应按照要求进行稀释和使用，底物溶液一定要现配现用。

第四，显色时阴性对照刚出现微黄色时，应立即终止反应。

第五，用阳性阴性比方法判定结果时，阴性对照孔若小于0.1，则易出现误判。

第六，用自动酶联仪检测时，应按仪器规定说明确定调零孔。

第七，同一稀释度2个孔的490纳米波长光密度值的平均值，为该稀释度的光密度值，对照孔应作同样处理。

③猪瘟单克隆抗体纯化酶联免疫吸附试验A.材料本试验的试剂盒由中国兽药监察所提供。本抗原包括猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原和猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原，分别供检测经猪瘟弱毒疫苗免疫后产生的抗体和感染猪瘟强毒后产生的抗体之用。同时提供酶标抗体，阳性、阴性血清，酶联板及其他器材和试剂。B.试验方法第一，用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各做100倍稀释，以100微升分别加入做好标记的酶联板孔中，置湿盒于4℃过夜。

第二，弃去孔内液体，用洗涤液冲洗板3次，每次间隔3～5分钟，拍干。

第三，用稀释液将待检血清作400倍稀释，每孔加入100微升，同时将猪瘟阳性阴性血清以100倍稀释作对照，37℃下培育1.5～2小时。

第四，重复第二步。

第五，用稀释液将兔抗猪免疫球蛋白G辣根过氧化物酶结合物作100倍稀释，每孔加入100微升，37℃下培育1.5～2小时。

第六，重复第二步。

第七，每孔加入底物溶液（每块板所需的底物溶液按邻苯二胺5毫克加底物缓冲液5毫升加30%双氧水18.75微升配制）100微升，室温下观察显色反应（一般阴性对照孔略微显色，立即终止反应，并以阴性孔作空白调零）。

第八，每孔加入终止液50微升，于酶联读书仪上测定490纳米波长的光密度（OD）。C.判定标准a.在猪瘟弱毒酶联板上光密度＞0.2为猪瘟弱毒抗体阳性。

光密度＜0.2为猪瘟弱毒抗体阴性。b.在猪瘟强毒酶联板上光密度≥0.5为猪瘟强毒抗体阳性。

光密度＜0.5为猪瘟强毒抗体阴性。

D.注意事项第一，运输单纯纯化酶联抗原时，必须使用冰盒低温运输。

第二，配制洗涤液时，应使用新鲜蒸馏水或无离子水；每次洗板后，尽量不使孔中有残余液体，以免影响结果。

第三，底物溶液临用前配置，待邻苯二胺完全溶解于底物缓冲液后再加双氧水，混匀后立即加入孔中。

第四，终止反应后，应立即读数。200.猪场兽医检验室应配备哪些器材和试剂？

（1）设备类：猪场兽医检验室配备的主要设备有电冰箱、电热培养箱、电热干燥箱、台式离心机、超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、蒸馏水器、微量血清振荡器、组织捣碎机等。

（2）器械类：猪场兽医检验室配备的主要器械有普通天平、研钵、铁三脚架、酒精灯、石棉网、试管架、接种棒、带盖搪瓷盘、铝饭盒、微量反应板（V型）、微量移液器（100微升、250微升）、普通剪刀、眼科剪刀、眼科镊子、长镊子、手术刀等。

（3）猪场兽医检验室配备的主要玻璃器材：有玻璃注射器、试管、刻度吸管、烧杯、三角烧瓶、玻璃漏斗、量筒、玻璃珠、载玻片、盖玻片等。

（4）试剂类：猪场兽医检验室配备的主要试剂有95%乙醇、氯化钠、氢氧化钠、碱性复红、结晶紫、沙黄、姬姆萨、甲醇、甲醛、草酸铵、甲基红、营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂、三糖铁琼脂、微量生化反应管、二甲苯、显微镜油、擦镜纸、常用猪病血清学诊断试剂盒等。

附录：猪的实用生理常数

释义：进入人或动物体的血液中能使血清产生抗体并与抗体发生化学反应的有机物质。 一定种类的抗原只能促使血清中产生相应的抗体。

注音：kàng yuán

造句：

1, 补体结合试验是测定抗原、抗体的一种敏感技术。

2, 冰冻切片的抗原也在第四周开始出现，定位在卵黄膜及卵壳上。

3, 除此之外，博来霉素水解酶还参与抗原呈递，水解老年痴呆APP蛋白和解除硫代内脂同型半胱氨酸的毒性作用。

4, 这种细胞死亡在淋巴细胞发育、淋巴细胞对外源抗原应答的调节，对自身抗原耐受的维持中发挥重要作用。

5, 目的：探讨负载自身抗原的未成熟树突状细胞在体内外诱导免疫耐受的作用，为探索新的主动免疫方法防治SLE提供依据。

6, 因此，逐步搞清我国小麦生产品种以及重要抗原材料的抗病基因组成及其遗传特点是合理利用抗病品种的基础。

7, 本文对27株败毒梭菌进行了抗原的血清学分型。

8, 他们发现通过戴帽子也就是说其携带的抗原受体，这就成了很简单的数字问题，因为调控T细胞可以盯住很多不同的非调控细胞。

9, 但这些抗原多属自身抗原，普遍存在免疫原性低，易引起免疫耐受等缺陷。

10, 方法该文采用细菌培养、肥达反应、伤寒杆菌H抗原酶联免疫检测检查52例伤寒患者，20例正常人，进行对照观察。

目录1 概述2 CA724的别名3 糖链抗原724的医学检查 3.1 检查名称3.2 分类3.3 取材3.4 糖链抗原724的测定原理3.5 试剂3.6 操作方法3.7 正常值3.8 化验结果临床意义3.9 附注3.10 相关疾病 这是一个重定向条目，共享了糖链抗原724的内容。为方便阅读，下文中的 糖链抗原724 已经自动替换为 CA724 ，可 点此恢复原貌 ，或 使用备注方式展现 1 概述

糖类抗原糖链抗原724（CA724）是高分子量类粘蛋白分子，分子量大于1000kD。由单克隆抗体B723及CC49所识别，是通过乳腺癌肝转移灶的癌细胞膜免疫所制备。CA724也是胃肠道和卵巢癌的肿瘤标志。

2 CA724的别名

糖链抗原724

3 CA724的医学检查3.1 检查名称

CA724

3.2 分类

血清学检查 >肿瘤免疫检测

3.3 取材

血液

3.4 CA724的测定原理

本法是标记抗原（Ag·）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争抑制反应，其反应为Ag·＋Ag＋Ab（Ag·Ab）＋（AgAb）。当Ag·和Ab的量保持恒定，Ag与Ag·之和大于Ab上的有效结合点的数目，在该条件下，Ag与Ag·间存在着函数关系，亦即随着Ag浓度增加，AgAb生成量多，而Ag·Ab的数量则减少，游离的Ag·就增多。因为Ag·对Ab的结合，可因Ag竞争结合而遭抑制。反之，当Ag量少时，AgAb生成量就少，Ag·Ab量增多，而游离的Ag·减少（图1）。将结合的抗原抗体复合物（B）与游离抗原（F）分离，分别测定B和F的放射活性，计算出B/F或B/B＋F值，可制出B/F或B/B＋p对Ag量的关系曲线图。测定时，需用一系列已知浓度的Ag和一定量Ag·及相应抗体Ab混合，然后测出各标准浓度Ag参加下的Ag·Ab放射结合率（B/B＋F）或（B/F），绘出竞争抑制标准曲线（图2）。试验时，在同样条件下，根据被测Ag的放射性结合率，从标准曲线上查知相应Ag含量。

3.5 试剂

（1）抗原的纯化：试验需用高纯度的抗原。通常，蛋白质抗原的纯度应达到电泳分析纯，电泳后仅显示单一区带，并具有足够或完整的免疫原性。一般先经聚丙烯酰胺电泳鉴定，再用等电聚焦SDS聚丙烯酰胺双相电泳鉴定为单一区带，然后用于免疫动物和核素标记。

纯抗原因其溶液中缺乏其他蛋白质作稳定剂，或因贮存在纯离子浓度的缓冲液中，故易形成聚合物，因此在纯化抗原时需加注意。若采用聚合物抗原的标记，用于RIA中将会显著增加非特异性结合，降低测定的灵敏度。

（2）抗原的标记方法：标记用的核素有γ射线和β射线两大类。前者常用131I、125I、51Cr,后者多用3H、32P和14C。选择放射性核素首先要考虑比放射性，比放射性愈高，参与反应的抗原化学量就愈小，测定方法的灵敏度相对就愈高。核放射性和半衰期要适宜，便于使用和防护。标记后的抗原要保持其免疫原性。标记技术要简便、经济。

标记方法有直接标记和间接标记两大类，以最常用的125I为例分述如下。

①直接标记：将125I直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上，步骤单一，操作简便，标记物的比放射性较高，但此法仅能用于标记含酪氨酸的化合物，如所含的酪氨酸残基为蛋白质的特异性和生物活性所必需，则该活性易因标记而失活。

最常用的直接标记法为氯胺T标记法（简称hT）：氯胺T是对甲基苯磺基酰胺的N氯衍生物的钠盐，在水溶液中分解形成次氯酸成为一种氧化剂。在偏堿溶液中（pH值7.5）能使带负电荷的125I离子（Na125I）氧化成带正电荷的125I离子，借以取代蛋白质酪氨酸苯环的氢，形成二碘酪氨酸。

125I标记率的高低与抗原（蛋白质或多肽）分子中酪氨酸的含量及其在分子中的暴露程度有关。

标记方法的原则是将纯化抗原和125I加入小试管底部，继将配制的氯胺T快速冲入，混匀振荡1～2min后加入偏重亚硫酸钠终止反应。再加碘化钾溶液稀释，然后在葡聚糖G50柱上分离，分别用井型闪烁计数器测定放射性强度（脉冲数/min、cpm），前部为标记抗原峰，后部为游离125I峰。在标记抗原峰试管中加等量1%白蛋白作为稳定剂即为标记抗原液。

②间接标记：是先将125I标记在载体上，纯化后再与蛋白质或肽抗原结合，用N琥珀酰亚胺3[4羟5（125I）碘苯]丙酸盐（NSHPP）作为间接标记试剂，该试剂的N琥珀酰亚胺基与多肽游离氨基缩合为结合物，使125I标记的苯基与蛋白质的氨基结合。

本法先以氯胺T使125I接上NSHPP，由于在水溶液中它迅速水解为3（4羟苯基）丙酸，故在碘化反应中要尽快减少这种水解作用。这种碘标记物必须从水箱抽提到有机溶液中去，再除去有机溶剂后，使125INSHPP与蛋白质结合，制成125INSHPP蛋白质标记物。

本法可标记缺乏酪氨酸残基的多肽，其最大优点是不损伤蛋白质的活性，能保存标记物高度的酶活性或免疫活性，适合于对不稳定的蛋白质标记，缺点是操作复杂，标记率低。

（3）标记抗原的鉴定：为保证放射免疫测定的质量，制备的标记物必需作如下鉴定：

游离放射性碘的含量  用三氯乙酸将所有蛋白质沉淀，分别测定沉淀物和上清液的cpm值。一般要求游离碘占总放射性碘的5%以下。标记抗原贮存过久时，可出现标记物的解离，一旦超过5%则应废弃。

免疫活性  用小量标记抗原加过量抗体，反应后分离B和F，分别测定其放射性，算出百分结合率，此值应在80%以上，值越大，表示损伤抗原越少。

放射强度  它是指单位重量抗原的放射强度，比放射性越高，测定越敏感。标记抗原的比放射性以125I的标记率或利用率表示。

（4）抗体的制备和鉴定  RIA中所用的抗体应具有高亲和力和高特异性，制备高价单相抗血清，最好以标记用的纯化抗原免疫动物，制备半抗原的抗血清，需先将半抗原与载体结合，使成免疫原，常用的载体为牛血清白蛋白。

抗血清同样也要加以严格鉴定，包括其灵敏度、亲和力和特异性。在固定量标记抗原与不同浓度的抗血清作用的条件下，测定B/F值，制得一条B/F值对不同稀释度抗血清的曲线图（图3），该曲线的直线部分上段的斜率是抗体最大亲和力的定性标志，也是灵敏度的标志。斜率越大，RIA灵敏度越高，在许多RIA反应系统中，呈最大灵敏度的抗体浓度为B/F＝1。

当采用固定量的抗体（Q0）与不同浓度的抗原作用时，以B／F对B作图，所得曲线的斜率就是亲和常数（Ka）的负数（图4）。

在RIA反应系统中，测定结构相似的不同物质时，可以鉴定抗体的特异性。

3.6 操作方法

本法分三个步骤，即抗原与抗体反应、B和F分离和放射性测定。

（1）抗原与抗体反应：将标本（非标记抗原）、标记抗原和抗血清顺序定量加入小试管内，置室温（15～30℃）作用24h，使其充分竞争结合。

（2）B、F分离：分离技术多种多样，常用沉淀法。①第二抗体沉淀法：又称双抗体法，在受检抗原与第一抗体特异性反应后加入相应的第二抗体，使形成的抗原第一抗体第二抗体的复合物共沉，一经离心即可使结合标记抗原B与游离抗原F分离。本法是特异性沉淀，分离完全，非特异性结合力低。但第二抗体用量较大，成本较高。此外血清浓度、抗凝剂的有无因素可在一定程度上影响结果。②聚乙二醇（PEG）沉淀法：使蛋白质处于等电点状态，水化层破坏而导致蛋白质沉淀。本法优点是PEG制备方便、价廉、分离快速，缺点是非特异沉淀物较多，分离不完全。③第二抗体聚乙二醇沉淀法：本法既有PEG法的快速沉淀优点，且保持第二抗体特异性沉淀的作用，又减少第二抗体用量，并降低PEG浓度，使非特异沉淀物减少。④活性炭吸附法：利用活性炭表面活性将小分子的游离部分吸附。如在活性炭表面涂上一层葡聚糖，使它表面具有一定孔径的网眼，从而允许小分子游离抗原或半抗原逸入而被吸附，而大分子复合物则被排斥在外。在抗原与抗体反应后，加入葡聚糖活性炭，放置5～10min，使游离抗原吸附在活性炭颗粒上，离心使颗粒沉淀，上清液中含有结合的标记抗原。

（3）放射性强度测定：B和F分离后，即可测定其放射性强度。测量仪器有两类：液体闪烁计数仪（测β射线）和晶体闪烁计数仪（测γ射线）。计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为cpm（脉冲数/min）。

每次测定均需作一标准曲线图，以标准抗原的不同浓度为横坐标，以测到的相应放射性强度为纵坐标作图。放射性强度可任选B或F，亦可采用计算值B/B＋F、B/F或B/B0。标本应作双份测定，取其平均值，在标准曲线上查出相应的受检抗原浓度。

3.7 正常值

＜6kU/L。

3.8 化验结果临床意义

（1）肺癌患者血清CA724水平常明显增高，CA724在不同病理类型亦有差异，以未分化、低分化癌为最高，中高分化癌次之。动态测定血清CA724水平对肺癌的病情监测、疗效评价及复发诊断具有重要的临床意义。

（2）血清CA724水平增高还可见于胃癌、大肠癌、卵巢癌及乳腺癌等恶性肿瘤，动态测定血清CA724水平有助于对上述肿瘤的病情监测、疗效评价及复发诊断。

（3）血清CA724和CEA联合检测对上述恶性肿瘤的诊断具有互补作用。

3.9 附注

CA724对诊断胃癌的特异性优于糖链抗原199和CEA。

3.10 相关疾病

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