NK细胞毒性检验的方法

方法首先将外周血单个核细胞（PBMCs）与K562细胞以3：1比例混合，2h后加入莫能菌素，1．5h后加入CD107a和CD56标记抗体，流式细胞仪分析CD107a阳性细胞的频率。其次观察CD107a抗体孵育时间、不同效靶比例对CD107a阳性细胞检测的影响。最后观察该方法与传统LDH释放法检测NK细胞毒活性的一致性。结果NK细胞活化后可在其表面检测到高水平表达的CD107a分子，效靶细胞孵育结束后加入CD107a抗体可降低检测背景，低效靶比例同样具有检测敏感性。该方法与LDH释放法的检测结果一致。结论利用CD107a抗体标记检测NK细胞毒活性的方法具有快速、敏感、所需效应细胞少的优点。

cd107a是nk细胞的抑制受体

自然杀手细胞（英语：natural killer cell）是一种细胞质中具有大颗粒的细胞,也称NK细胞（NK cell）.由骨髓细胞发育而成.因为其非专一性的细胞毒杀作用而被命名.没有T细胞与B细胞所具的受体,不会进行受体的基因重组.但仍具有一些特殊受体,可以活化或抑制其作用在血液中循环,但也在骨髓,脾脏、淋巴结中出现,约占所有淋巴球的细胞的5~10%,但它可以消灭许多种病源体及多种肿瘤细胞.

K细胞即自然杀伤细胞.

自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)是机体重要的免疫细胞,不仅与抗肿瘤、 抗病毒感染和免疫调节有关,而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生.

目的 恶性肿瘤的发生率与致死率依然呈上升趋势,作为一种有可能治愈肿瘤的新型方法,过继免疫治疗得到广泛关注,其中细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells, CIK)免疫治疗已被广泛应用。目前,临床上主要应用的是外周血来源的CIK细胞,但外周血CIK细胞免疫治疗存在一定的缺陷性,如增殖速率低、体内存活时间短,抗凋亡能力差。本研究主要比较了脐血与肿瘤患者外周血来源CIK细胞的增殖、免疫表型、免疫原性、激活型和抑制型表面标志物、耐药基因ABCG2的表达及化疗药物处理后的抗凋亡能力并建立食管癌的移植瘤模型,比较两种CIK细胞在体内杀伤肿瘤细胞的能力。 方法 使用Ficoll-Plaque淋巴分离液分离脐血单个核细胞(cord blood mononuclear cell, CBMC)及肿瘤患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),重悬于RPMI1640培养基(含10%胎牛血清),加入细胞因子IFN-γ (interferon-γ),抗CD3单抗和IL-2(interlukin-2)诱导培养CIK。使用流式细胞术检测脐血与外周血CIK的增殖、免疫表型、免疫原性、激活型表面标志物(CD28、CD27)和抑制型表面标志物(PD-1)的表达采用Annexin V/PI双染法检测顺铂处理后CIK细胞的凋亡情况使用qRT-PCR检测耐药基因ABCG2的表达使用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测IFN-γ、IL-2、TNF-α (tumor necrosis factor-α)的分泌使用流式细胞术检测CIK细胞CD107a的表达另外,购买5周龄的Balb/c裸鼠,随机分为3组,每组5只。裸鼠.皮下接种1×107个KYSE70细胞,成瘤后,通过尾静脉分别输注磷酸盐缓冲液(Phosphatate buffered salin, PBS)、脐血CIK细胞、外周血CIK细胞一次,然后观察皮下肿瘤体积变化。 结果 脐血CIK培养第10d时增殖指数(proliferation index, PI)显著高于外周血CIK [(251.52±16.76) vs (158.00±43.19), P<0.05]。脐血CIK经诱导培养13d后HLAⅠ、HLAⅡ的表达显著低于外周血CIK[(18.86±±9.76)%vs(65.63±10.02),(14.53±3.34)%vs(67.20±±4.50)%,P<0.01],其中CD8HLAⅡ、CD4HLAⅡ和CD8HLAⅠ的表达较外周血CIK低[(5.86±0.53)%vs(51.20±4.85)%,(2.32±±0.34)%vs(12.42±±3.65)%,(17.56±±1.85)%vs(52.10±±5.72)%,P<0.05], CD4HLAⅠ的表达无差异(P>0.05)。脐血CIK中CD3+CD56+细胞比例较外周血CIK高[(21.20±±4.82)%vs(10.06±±3.46)%,P<0.05]脐血CIK中激活型CD4+CD28+、CD4+CD27+和CD8+CD27+T细胞比例较外周血CIK中高[(32.40±±16.81)%vs(18.65±±9.23)%,(27.48±±13.53)%vs(0.98±±0.55)%,(41.76±13.98)%vs(2.58±±2.10)%,P<0.05或P<0.01]而抑制型CD8+PD-1+T细胞的含量明显较低[(3.25±2.13)%vs(8.05±±9.23)%,P<0.01],两者中CD8+CD28+、CD4+PD-1+T细胞的含量无显著差异(P>0.05)。此外,脐血CIK高表达耐药基因ABCG2。顺铂处理13d后的脐血CIK细胞凋亡率显著低于外周血CIK细胞[(10.10±4.20)%vs (27.12±12.18)%, P<0.05]。 ELISA检测显示脐血CIK分泌的IFN-γ、IL-2较外周血CIK高(P<0.01),TNF-α的分泌无显著差异[(4.70±0.44)pg/ml vs (4.82±0.51)pg/mL, P>0.05]。脐血CIK上CD107a的表达显著高于外周血CIK细胞[(9.16±±1.58)%vs(2.36±±0.86)%,P<0.01]。裸鼠体内试验表明,脐血CIK杀肿瘤的能力显著高于外周血CIK。 结论 与外周血CIK相比,脐血CIK增殖能力强、活化水平高、抗凋亡能力强、细胞因子分泌水平高,并且对肿瘤的杀伤功能强、治疗效果好,具有较佳的临床应用潜能。

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