石蜡切片法是以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将材料切成薄片,经一系列处理制成永久制片的方法.在研究植物的细胞,组织,胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法.
石蜡切片法的一般流程为:取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片.
取材
用锋利的刀片切取新鲜的植物材料,选定适宜的材料,立即固定.
取材的注意事项如下:
(1)取材料要新鲜.动作要迅速,以免挤压损坏组织取病理材料时,应设置对照材料.
(2)所取材料大小要适当:根和茎一般直径≤5mm,切取成5-10mm小段叶片一般取过中脉处,切成2-5mm宽,5-8mm长.在切材料时,必须注意刀片与中轴成直角,两切面平行,否则制成的切片细胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.
(3)取材时间可根据切片要求有所区别.如:在进行植物发育的研究过程时,需要找到细胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00时取材,此时植物细胞分裂活动较明显.
(4)取材不易过老,否则制片有难度(过老的材料须在滑走切片机上进行)对纵切的材料适当多取材,如根尖,茎尖等,因为切到材料正中的概率较低.
(二)固定
将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中.借助固定液的作用,使细胞的新陈代谢瞬时停止,并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化.从而达到使组织变硬从而便于切片,增强内含物的折光度,令细胞易于着色的目的,同时具有防腐作用.以新鲜配制固定液效果较好.固定的时间依材料的种类,性质,大小等而定.材料固定完毕,保存于加盖的容器内,贴上标签.
良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固不发生任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色.
常用固定液:
简单固定液 以一种化学药品配制的固定液.
⑴ 乙醇 为凝固型固定剂.常用无水乙醇或95%乙醇.
⑵ 甲醛 为非凝固性固定剂.具强烈刺激性气味.纯净的甲醛为无色透明液体.固定用的浓度为4%-10%.
⑶ 醋酸 为凝固型固定剂.为无色透明的液体,刺激性极强,低温下凝结成冰,故又名冰醋酸.
2. 混合固定液:
由几种试剂,适量配制而成.混合遵循原则:① 优缺点互补② 膨胀与收缩相互平衡③ 强氧化剂与还原剂应分别配置.
常用混合固定液有下列几种:
⑴ FAA 固定液(福尔马林-冰醋酸-乙醇) 广泛适用于根,茎,叶,花药,子房的组织切片,所以又称为万能固定液.一般固定时间不低于24 h.该固定液优点是在较低温度下(10℃左右)适用于材料的长期保存,可兼作保存液.并且固定的材料,不妨碍染色,但用于细胞学上的固定效果较差.
⑵ 纳瓦兴(Navaschjn's)固定液 1912年首创.适用于细胞学与组织学研究的切片观察.但渗透慢,不能长期保存主要用于显示分裂相.
(三)抽气
植物材料内部多由于含有空气,导致固定液不能完全深入.材料投入固定液后需要立即抽气.以便让固定液有效透入材料组织中,并排除材料内气泡的干扰.
一般抽气时间为20-30 min.抽过气的材料在停止抽气,应沉入底部.
(四)洗涤
固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶,影响观察有的还会继续作用,使材料变质等.因此,在使用材料时,需根据固定液的种类,用水,缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液.如:用FAA固定的材料在脱水时用70%乙醇反复洗涤数次.如用水洗涤,可将材料自固定液中取出,放入指形管,加入半管水,用纱布将管口扎紧,置于水槽内,进行流水冲洗.流水冲洗时间一般为12-24 h.
(五)脱水
材料经洗涤后含有部分水分,会使材料分解.而且透明剂与水是不相混合的,不利于材料的透明和包埋等后期处理.因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分,以便让石蜡渗透进细胞.所以,脱水是制片的关键环节.脱水剂要求能与水混合,而且能与其他有机溶剂互相替代.
脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行,防止吸收空气中的水分在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料,以免损坏材料.
(六)透明
透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质,可以将材料中的脱水剂置换出来,使石蜡能顺利进入材料中.
二甲苯是目前应用最广的透明剂,作用迅速,但易使材料变脆..
(七)浸蜡
是指逐步清除材料中的透明剂,以使石蜡充分渗透于材料内部的过程.这样,材料的各部分都能保持原来的结构与位置,切片不致发生破裂或其他变形.
浸蜡是一个渐进的过程,常用的正丁醇.
每次浸蜡的时间,视材料大小而调节.
(八)包埋
材料经过足够时间的浸蜡后,需包入蜡块,以备切片.
操作方法:根据切片材料大小,确定所需纸盒的尺寸,用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒.
(九)切片
即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带.
(十)贴片
是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上,以便于染色和观察.
常用的粘片剂有下列二种:
(1) 明胶黏片剂
(2) 蛋清黏片剂
(十一) 染色
即根据植物细胞中不同的化学性质,用染料分别进行染色,以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等.染色基本程序为脱蜡,染色,分色封片.
染色方法可分为下列几类:
① 单染 只用一种染料染色.
② 双重染色 两种染料染色,如番红--固绿苏木精---曙红.
③ 多重染色 多种染料染色,如番红—固绿—桔红G酸性品红—苯胺蓝—桔红G等.
(十二) 封藏
封藏于中性树胶中,使材料能在显微镜下清晰地显示出来,并能长期保存.
方法:将含材料的载玻片放在吸水纸上(切片一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(必须在二甲苯干燥前进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触,然后再缓慢地放下,避免产生气泡.
冷冻切片法：
冷冻切片的制作方法
（1）低温恒冷箱冷冻切片制作法
1．本室现有Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机的主要性能。该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。
冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。
2．操作方法及步骤：
①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。
②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。
③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。
④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。
⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。
⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。
3．冰冻切片时的注意事项：
①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。
③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。
④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。
⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。
⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。
4．冰冻切片的快速染色法
冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。
方法：
① 切片固定30秒－1分钟。
② 水洗。
③ 染苏木素3－5分钟。
④分化。
⑤ 于碱水中返蓝20秒。
⑥ 伊红染色10－20秒。
⑦脱水，透明，中性树胶封固。
冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。
冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。
胰岛素功能检测包括：
C-肽糖化血红蛋白血红蛋白A1C
血清糖化蛋白（GSP）
胰岛素胰岛素原胰高血糖素等。
胰岛素功能检测参考值：
C-肽正常值 成人≤4.0μg/L 男1.5～5.0μg/L 女1.4～5.5μg/L。
糖化血红蛋白血红蛋白A1C正常值
电泳法 占Hb总量的0.056～0.075 柱层析法 占Hb总量的0.06～0.09
高压液相色谱法 HbA1a 0.016 HbA1b 0.008 HbA1c 0.03～0.06。
血清糖化蛋白（GSP）正常值 果糖胺法 [2.5mmol/L。
胰岛素6～24mIU/L。
胰岛素原正常值 [0.2μg/L 或[0.3IRI。
胰高血糖素 正常值 30～210ng/L。
胰岛功能检测解释：
胰岛素功能检查包括胰岛素、C肽、血糖测定。胰腺组织是人体内的重要内分泌器官，其分泌的胰岛素能促进肝脏、肌肉和脂肪等组织摄取和利用葡萄糖，是体内唯一降低血糖的激素。C肽是胰岛素时段下的肽段，不被肝脏蛋白酶所破坏，因此在检测胰岛素的同时测定血中的C肽含量，可以更真实地反映胰岛的分泌功能。血糖测定则是间接地反映胰岛素功能。
胰岛功能检查的作用：
是看看你的胰岛分泌胰岛素的功能怎么样，是不是受损了，是检查早期糖尿病的常用方法。胰岛功能检查应该是在早晨空腹的情况下,进食75g葡萄糖或100g面粉的馒头前后分别于空腹,餐后1小时,2小时,3小时抽静脉血测定四个时间点的血糖,胰岛素释放,C-肽值.胰岛功能检查有几项，包括胰岛素释放试验、C肽释放试验。做法：糖尿病人选用馒头餐或者口服75g葡萄糖，取血同时进行葡萄糖和胰岛素、C肽等的测定。作用是测定胰岛素的含量是绝对还是相对不足，确定糖尿病的情况，决定用药。
胰岛功能检查步骤：
(1)试验应在上午7～11时之间进行。早8：30以前到医院、并顺便携带当天早晨第一次小便10ml送检。
(2)空腹坐位抽血后5分钟内饮入250ml含75g葡萄糖的糖水对于部分糖尿病人，为减少对B细胞的强烈刺激，可以进食2两左右的(约100克)馒头代替葡萄糖妊娠期妇女葡萄糖的用量为100g儿童按1.75g/kg体重计算，但总量不超过75g。
(3)进食后0.5小时、1小时、2小时、3小时分别抽血检测血糖。常规口服葡萄糖耐量试验的同时，平行测定血样中的胰岛素浓度。根据5次血中葡萄糖水平(空腹时坐标点为0)绘制糖耐量曲线，同时根据5次血浆胰岛素水平绘制出胰岛功能曲线。
患糖尿病时，无论空腹血浆胰岛素水平，还是胰岛素释放试验分泌曲线均较常人有明显不同，1型糖尿病患者胰岛素分泌减少，空腹血浆胰岛素水平明显低于正常，其基值一般在5mu/L以下，服糖刺激后其胰岛素释放也不能随血糖升高而上升，常呈现无高峰的低平曲线，有些病人甚至不能测出。2型糖尿病患者空腹血浆胰岛素水平可正常，或稍低于正常，但往往会出现高峰时间延迟，如在服糖后2小时或3小时出现，呈分泌延迟高峰后移。其中尤其是肥胖型的糖尿病病人，血浆胰岛素释放曲线明显高于正常，但低于同体重的非糖尿病病人的释放曲线。进食后胰岛素分泌高峰后延(2～3小时)是2型糖尿病的特征。
不过胃切除术后或严重的肝病等，肠道迅速吸收葡萄糖，而肝脏不能相应快速摄取葡萄糖所致。以上两类病人不宜进行口服葡萄糖耐量试验，需采用静脉注射葡萄糖耐量试验。
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